[發明專利]一種基于納米孔測序的快速鑒別呼吸道微生物引物組、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202011322960.1
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112501268B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 周其偉;劉歡;楊學習;李明
• 申請（專利權）人: 廣州市達瑞生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6895;C12Q1/6893;C12Q1/689;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種基于納米孔測序法檢測呼吸道微生物的引物組，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～20所示，所述微生物為：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌(耐甲氧西林)、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、白色假絲酵母、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、屎腸球菌、鸚鵡熱衣原體、格特隱球菌、煙曲霉、耶氏肺孢子蟲。本發明針對呼吸道微生物的不同類型樣本進行測序優化，使得檢測方法、試劑盒等適用于多種類型的呼吸道樣本，采用靶向擴增的方法，能滿足痰液以及肺泡灌等樣本類型的檢測需要。此外，本發明可進行平行測序，增加檢測樣本通量，降低測序時間，進一步減輕檢測病原種類通量與成本和時間的矛盾。

技術領域

本發明涉及呼吸道微生物的檢測領域技術領域，更具體地，涉及一種基于納米孔測序的快速鑒別呼吸道微生物引物組、試劑盒及其應用。

背景技術

致病微生物侵入呼吸道并進行繁殖導致的疾病稱呼吸道感染。呼吸道感染的病原微生物種類繁多，感染癥狀相似，臨床上難以鑒別，并且常常發生多種病原微生物的合并感染。由于精準診療亟需對癥下藥，因此需要對多重病原微生物的鑒別。

病原微生物類型鑒別的最直接的方法是進行病原微生物核酸檢測。目前常用的呼吸道病原微生物在臨床的檢測方法有病原微生物培養以及核酸檢測方法，如qPCR或者QF-PCR方法、質譜等方法，其中病原微生物培養耗時長，培養陽性率低；qPCR或QF-PCR方法的選擇靶點單一，容易造成檢測偏差，引起假陽性或假陰性，質譜方法也需要經過培養再進行鑒定，耗時長。因此，上述方法在呼吸道病原微生物的臨床檢測上都具有明顯的局限性。

目前基于PCR方法檢測病原體微生物的專利居多如：CN101985665A《一種檢測多種呼吸道病毒的方法及其引物與探針》、CN103074451A《一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法》、CN104342503A《一種同時檢測12種常見呼吸道病毒的方法》、CN105734168A《一種12種呼吸道病毒核酸多重PCR檢測試劑盒》、CN109609692A《用于檢測呼吸道感染病原體的核酸試劑、試劑盒、系統及方法》、CN110894533A《用于檢測下呼吸道感染細菌的核酸試劑、試劑盒及系統》。以上專利共同點是多重熒光PCR或基因芯片的方法進行檢測，但無法對病原的序列進行分析，如果病原體濃度比較低接近試劑盒的檢測限時，此時的結果存在一定的不確定性。納米孔測序平臺具備讀長長、實時簡單快速、測序通量高、便攜性高、裝機成本相對低等優點。相比mNGS方法，納米孔測序對病原體的檢測和和分型可在基層實驗環境或現場完成，有助于病原體的快速檢測。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于納米孔測序的快速鑒別呼吸道微生物引物組、試劑盒及其應用。

本發明的第一個目的在于提供一組基于納米孔測序法檢測呼吸道微生物的引物。

本發明的第二個目的在于提供所述引物組中的一條或幾條引物在制備檢測呼吸道微生物的試劑盒的應用。

本發明的第三個目的在于提供一種基于納米孔測序的檢測呼吸道微生物的試劑盒。

本發明的上述目的是通過以下方案予以實現的：

本發明給予一種新的基于納米孔測序的快速鑒別呼吸道微生物引物組設計思路，設計了針對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌（耐甲氧西林）、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、白色假絲酵母、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、屎腸球菌、鸚鵡熱衣原體、格特隱球菌、煙曲霉、耶氏肺孢子蟲設計相應的檢測引物。

這里的引物設計思路是指，由于細菌的16S?rDNA基因相對比較，通過生物信息基因比對分析，選出合適的保守區域進行引物設計；真菌選擇ITS基因進行生物信息學分析然后進行引物設計；同時根據耶氏肺孢子蟲的特異性基因設計相應的擴增引物，通過設計引物組，實現基于靶向擴增測序對呼吸道微生物的檢測。