[發明專利]重組鼠Tet3蛋白原核表達及其穩定性研究

在審

• 申請號: 202011319429.9
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112575017A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 黃娟;李學斌
• 申請（專利權）人: 伊艾博（武漢）科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/53;C12N9/02
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發明名稱重組鼠Tet3蛋白原核表達及其穩定性研究摘要本發明公開了重組鼠Tet3蛋白原核表達及其穩定性研究的研究成果，探討了重組蛋白在液體保存狀態下溫度對其穩定性影響的問題。通過分子克隆技術，將鼠Tet3基因克隆至原核表達載體pET28a(+)上，成功構建重組質粒pET28a?Tet3；再對重組蛋白表達條件進行優化，分離純化出目的蛋白Tet3；對純化出的目的蛋白Tet3穩定性進行分析，主要選取3個溫度條件即常溫、4℃和37℃，分別保存60天來分析Tet3蛋白在液體保存狀態下的穩定性。本發明能表達純化出高純度高品質的重組鼠Tet3蛋白，并驗證出重組鼠Tet3蛋白在液體狀態保存條件下最優的保存溫度，為公司產品在運輸過程中的最佳保存條件提供一個好的理論依據。

技術領域

本發明涉及分子生物學與蛋白質組學領域，具體的是說重組鼠Tet3蛋白原核表達及其穩定性研究。

技術背景

DNA的胞嘧啶(C)5-甲基化是一種重要的表觀修飾，它參與基因調節、基因組印記、X-染色體失活、重復序列抑制和癌癥發生等過程。5-甲基胞嘧啶(5mC)可被TET(ten-eleventranslocation)蛋白家族進一步轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，該過程是DNA去甲基化的1個必要階段。5hmC可在活性轉錄基因起始位點和Polycomb抑制基因啟動子延伸區域富集。TET蛋白包括3個成員TET1、TET2和TET3，均屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶，其催化涉及氧化過程。小鼠Tet1在胚胎干細胞發育中擁有雙重作用，即促進全能因子的轉錄，又參與發育調節因子的抑制。人TET蛋白的破壞與造血系統腫瘤相關，如在骨髓增生性疾病/腫瘤存在頻繁的TET2基因突變。TET蛋白和5hmC的研究為DNA甲基化/去甲基化及其生物學功能提供了新的視點。

原核表達系統（大腸桿菌表達系統）是基因表達技術中發展最早，應用最廣泛的經典表達系統，近幾十年，大腸桿菌表達系統也不斷得到發展和完善，被科研及工業用戶大量用于各種重組蛋白表達。與其它表達系統相比，具有目的基因表達水平高，培養周期短，抗污染能力強，成本相對低等特點。

親和層析是利用生物大分子與某些相對應的專一分子特異識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法。親和層析是目前生產上應用最為廣泛的分離純化蛋白的方法之一，表達載體pET28a(+)上帶有6HIS標簽，可以應用鎳純化樹脂分離純化目的蛋白。通過選取3個溫度條件來摸索重組鼠Tet3蛋白在液體保存狀態下的穩定性，對產品在運輸過程中能否保持其穩定性提供很好的參考，也為公司重組蛋白產品在運輸過程中的最佳保存條件提供理論依據。

發明內容

本發明的目的是能表達純化出高純度高品質的重組鼠Tet3蛋白，并驗證出重組鼠Tet3蛋白在液體狀態保存條件下最優的保存溫度，為公司產品在運輸過程中的最佳保存條件提供一個好的理論依據。

技術方案包括以下步驟：

（1）人工合成鼠Tet3基因，Tet3和pET28a(+)經BamHl和Xhol 雙酶切后連接，構建重組質粒pET28a-Tet3。

（2）然后用CaCl2法將重組質粒分別轉化到原核表達宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，構建工程菌。

（3）構建好的工程菌用IPTG誘導表達，并從誘導溫度和IPTG濃度兩個方面對目標蛋白可溶性表達進行優化。

（4）用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白。

（5）探討溫度對重組鼠Tet3蛋白穩定性的影響。

所述步驟（1）中，查閱NCBI數據庫中鼠Tet3基因轉錄本，人工合成鼠Tet3基因，然后將pET28a(+)和Tet3基因經BamHl、Xhol雙酶切，通過連接轉化構建pET28a-Tet3。

所述步驟（2）中，將重組質粒分別轉化到原核表達宿主Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，目的是為了篩選目的基因最適合的表達宿主。