[發明專利]短波處熒光內濾技術在檢測半胱氨酸中的應用

有效

• 申請號: 202011318459.8
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112683861B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 孫遠強;曾華金;李瓊洋;楊冉
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 王紅培

本發明提供了一種短波處熒光內濾技術（SWIFT）在檢測半胱氨酸中的應用，短波的激發波長為254?nm。在短波處，將羅丹明6G溶解于DMSO中得到羅丹明6G儲備液，2?甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2?FPBA儲備液，將羅丹明6G儲備液和2?FPBA儲備液分別加入到PBS緩沖溶液中混合均勻，在混合液中加入半胱氨酸，在激發波長為254?nm下進行光譜測試。本發明以羅丹明6G作為熒光團，具有光穩定好，量子產率高，較寬的波長范圍等優點，在微摩爾級的Cys的存在下，2FPBA可以與Cys很好的反應，本發明可以實時監測熒光團的穩定性以及可回收利用。這為檢測Cys的存在提供了一種新的思路和方法。

技術領域

本發明涉及檢測半胱氨酸的應用領域，具體涉及一種短波處熒光內濾技術在檢測半胱氨酸中的應用。

背景技術

生物硫醇，如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)，在許多生理和病理過程中發揮重要作用。例如，Cys在氨基酸運輸、蛋白質合成、抗氧化損傷、提高胚胎發育速率等多種生理過程中發揮關鍵作用。谷胱甘肽是細胞中最豐富的硫醇，在細胞抵御毒素和自由基等生物過程中發揮著重要作用。在許多疾病中，Hcy作為生物標志物發揮著特殊的作用。一般來說，細胞內生物硫醇的水平與有毒物質和疾病有關。例如，Cys水平異常與生長遲緩、水腫、嗜睡、肝損傷等有關。血漿中Hcy升高是心血管疾病、阿爾茨海默病、骨質疏松癥的危險因素，而GSH水平高則與白細胞減少、癌癥、HIV感染等密切相關。因此，硫醇的檢測對評估疾病發生發展水平非常重要。

許多技術被用于檢測這些生物硫醇，如高效液相色譜(HPLC)、傅里葉變換紅外(FTIR)光譜、質譜(MS)、電化學分析、紫外/可見光譜和熒光光譜。熒光傳感因其簡單、成本低、選擇性和靈敏度高而受到廣泛關注。因此，近年來許多熒光探針被應用于檢測生物硫醇。大部分熒光探針是有共價連接的熒光基團和反應基團組成，生物硫醇與反應基團發生反應導致熒光基團的熒光強度的變化。然而，化學連接增加了探針的成本，并限制了探針的發展，使其只具有適合這種化學連接的化學基團。所以，本發明提供了一種熒光基團和分析物反應基團分離的設計方案，并應用于檢測半胱氨酸。

發明內容

本發明提出了一種短波處熒光內濾技術（SWIFT）在檢測半胱氨酸中的應用，主要采用商業熒光團羅丹明6G和簡單的化合物2-FPBA組合檢測半胱氨酸（Cys）。2-FPBA與Cys的巰基和氨基反應，引起在激發波長下（254?nm）的熒光內濾效應的減弱，從而使熒光團在激發波長下(254?nm)的熒光增強。

實現本發明的技術方案是：

短波處熒光內濾技術（SWIFT）在檢測半胱氨酸中的應用，短波的激發波長為254nm。

在短波處，利用羅丹明6G和2-甲酰基苯硼酸檢測半胱氨酸，其中商業熒光團羅丹明6G的結構式如下：

，簡單的化合物2-FPBA（2-甲酰基苯硼酸）的結構式如下：。

將羅丹明6G溶解于DMSO中得到羅丹明6G儲備液，2-甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2-FPBA儲備液，將羅丹明6G儲備液和2-FPBA儲備液分別加入到PBS緩沖溶液中混合均勻，在混合液中加入半胱氨酸，在激發波長為254?nm下進行光譜測試。

所述羅丹明6G儲備液的濃度為2?mM，2-FPBA儲備液的濃度為40?mM，PBS緩沖溶液的濃度為10?mM、pH為7.4，分別向2?mL?PBS溶液中加入羅丹明6G儲備液2?μL和2-FPBA儲備液5?μL作為檢測體系。

分別測試檢測體系加入Cys前后的紫外可見光譜和熒光光譜的變化，熒光的激發波長為254?nm；觀察紫外及熒光圖譜變化及其加入Cys前后熒光的變化。

熒光光譜的變化為：以254?nm光激發時，逐漸加入不同濃度的Cys后在564?nm處的熒光逐漸增強，并在某一濃度時達到最大值且保持不變。