[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于阪崎腸桿菌O抗原血清型分型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011316948.X
• 申請(qǐng)日: 2020-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112375833A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王磊;王婧;郭璽;劉斌;魯閣閣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南開(kāi)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專(zhuān)利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發(fā)明涉及一種對(duì)阪崎腸桿菌O1?O7血清型O抗原分型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法。本發(fā)明以阪崎腸桿菌O1?O7的O抗原基因簇內(nèi)的特異基因，即wzx和wzy為靶基因，設(shè)計(jì)并篩選了對(duì)阪崎腸桿菌O1?O7的O抗原分型的各自四條引物，并建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）反應(yīng)體系。為食品，特別是嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測(cè)和血清學(xué)分型提供了相應(yīng)技術(shù)。利用本發(fā)明的LAMP體系檢測(cè)阪崎腸桿菌，并且對(duì)其進(jìn)行血清學(xué)分型，具有操作簡(jiǎn)便和快速高效的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及對(duì)樣品中阪崎腸桿菌O1-O7血清型菌株O抗原分型的LAMP技術(shù)及其制備方法。本發(fā)明還設(shè)計(jì)利用所述的LAMP引物進(jìn)行檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)

阪崎腸桿菌感染能引起非常嚴(yán)重的疾病，尤其是在早產(chǎn)兒中。具體為引起腦膜炎、膿毒癥和致死性壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥。疾病和預(yù)防控制中心估計(jì)阪崎腸桿菌感染病例的病死率高達(dá)40 %。據(jù)報(bào)道，受感染的新生兒和嬰兒的病死率為50-80 %，其中20 %的幸存者發(fā)展為嚴(yán)重的神經(jīng)障礙。在年齡較大的兒童中，阪崎腸桿菌可以在胃腸腔定殖，報(bào)告顯示由此引起的病死率為10-55 %。該菌可從很多食品中分離出來(lái)，包括奶粉、干蔬菜和谷物粉，但最常見(jiàn)于嬰兒配方奶粉。

2017年6月27日，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB4789.40-2016）中采用食品微生物學(xué)的檢測(cè)方法對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行生化鑒定，該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但是缺點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)過(guò)程較復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)（約5-6天）；2011年7月1日中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局實(shí)施的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)（SN/T2754.15-2011）中采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）檢測(cè)方法對(duì)出口食品中的阪崎腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，但該標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)阪崎腸桿菌檢測(cè)至種水平，并未進(jìn)行血清型檢測(cè)，難以滿(mǎn)足對(duì)于食源性疾病病原體溯源的需求。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)原理為：60-65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。

擴(kuò)增分兩個(gè)階段：第1階段為起始階段，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補(bǔ)單鏈。FIP上的F1c與此單鏈上的F1為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動(dòng)類(lèi)似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3’末端的F1區(qū)段為起點(diǎn)。以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。

第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開(kāi)始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3’末端的B1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，形成DNA合成延伸及鏈置換，形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交，啟動(dòng)新一輪的擴(kuò)增，且產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成。周而復(fù)始，擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物，且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。

該方法具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，能在等溫（60-65℃）條件下，短時(shí)間（通常是一小時(shí)內(nèi)）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)，不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本較低。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)樣品中阪崎腸桿菌O1-O7血清型O抗原分型的LAMP引物，該引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。