[發明專利]由番茄紅素基因介導的改造的克隆載體及其應用

在審

• 申請號: 202011315896.4
• 申請日: 2020-11-22
• 公開（公告）號: CN112831517A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 馬小舒;李一凡;王嫚;吳政憲
• 申請（專利權）人: 南京金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種可在酵母和大腸桿菌中復制的克隆載體，所述載體在現有質粒載體中插入可在酵母內表達的番茄紅素基因作為顏色標記，其中所述的現有質粒載體選自下組：pCCI-Brick和pUC57-Brick。

2.根據權利要求1所述的克隆載體，其中所述番茄紅素基因包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列組成。

3.根據權利要求1或2所述的克隆載體，其中所述載體在番茄紅素基因的兩端各插入一個或多個只出現一次的酶切位點。

4.根據權利要求3所述的克隆載體，其中所述現有質粒載體為pCCI-Brick，且所述酶切位點選自：NheI、PacI、MauBI、MluI和PmeI，優選NheI和PacI。

5.根據權利要求3所述的克隆載體，其中所述現有質粒載體為pUC57-Brick，且所述酶切位點選自：SpeI、SmaI、PacI、PmeI、SalI、NotI、NheI、MauBI、MluI、PstI、FseI和SfiI，優選為SpeI和SmaI。

6.一種用權利要求1-5中任一項所述的克隆載體轉化的酵母細胞。

7.一種制備可在酵母和大腸桿菌中復制的克隆載體的方法，其包括如下步驟：

(1)根據番茄紅素基因的序列設計PCR擴增引物pf1和pr1，所述pf1包含番茄紅素基因5’端同源區域和選自NheI或SpeI的酶切位點，且所述pr1包含番茄紅素基因3’端同源區域和選自PacI或SmaI的酶切位點，以番茄紅素基因為模板，以pf1和pr1為引物擴增適于組裝所述克隆載體的番茄紅素基因片段；

(2)根據現有質粒載體的序列設計PCR擴增引物pf2和pr2，以現有質粒載體為模板，以pf2和pr2為引物擴增適于組裝所述克隆載體的現有質粒載體基因片段，其中所述現有質粒載體選自下組：pCCI-Brick和pUC57-Brick；

(3)將所述番茄紅素基因片段與現有質粒載體基因片段以等摩爾量混合并在酵母細胞中組裝以獲得所述克隆載體。

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述番茄紅素基因包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列組成。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其中所述現有質粒載體為pCCI-Brick，所述pf1包含5’同源區域SEQ ID NO:2和酶切位點NheI，且所述pr1包含番茄紅素基因3’同源區域SEQ IDNO:3和酶切位點PacI。

10.根據權利要求7-9中任一項所述的方法，其中所述現有質粒載體為pCCI-Brick，所述引物pf1和pr1分別為如SEQ ID NO:6所示的pCCI-f1和如SEQ ID NO:7所示的pCCI-r1。

11.根據權利要求7-10任一項所述的方法，其中步驟(2)中的現有質粒載體基因片段通過兩部分分別擴增，其中用于擴增第一部分的引物pf2a和pr2a分別為如SEQ ID NO:8所示的pCCI-f2和如SEQ ID NO:9所示的pCCI-r2，且其中用于擴增第二部分的引物pf2b和pr2b分別為如SEQ ID NO:10所示的pCCI-f3和如SEQ ID NO:11所示的pCCI-r3。

12.根據權利要求7或8所述的方法，其中所述現有質粒載體為pUC57-Brick，所述pf1包含5’同源區域SEQ ID NO:4和酶切位點SpeI，且所述pr1包含番茄紅素基因3’同源區域SEQID NO:5和酶切位點SmaI。