[發(fā)明專利]一種腫瘤細(xì)胞三維模型及其活力檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011308920.1
• 申請(qǐng)日: 2020-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN112501120A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪海峰;裴笑彤;叢妍;李亞輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)化工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12Q1/42
• 代理公司: 沈陽(yáng)技聯(lián)專利代理有限公司 21205
• 代理人: 張志剛

1.一種腫瘤細(xì)胞三維模型，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞三維模型包括用瓊脂糖凝膠培養(yǎng)法培養(yǎng)HT29細(xì)胞培養(yǎng)三維細(xì)胞球，顯微鏡下考察細(xì)胞球形態(tài)；通過測(cè)量細(xì)胞球提及，繪制細(xì)胞接種數(shù)對(duì)細(xì)胞球體積曲線；使用酸性酶APH、MTT法、測(cè)定相應(yīng)的吸光度值，繪制細(xì)胞接種數(shù)與吸光度值曲線；通過吉非替尼和紫杉醇處理三維細(xì)胞球；

建立細(xì)胞三維模型具體步驟：

1．用于腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的瓊脂糖凝膠的配置

1） 精密稱量瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入蒸餾水，制成 1 % 的瓊脂糖懸浮液；

2）加塞密封，放入高壓滅菌鍋內(nèi)高溫滅菌；

3） 滅菌完成后，即成瓊脂糖溶液，冷卻后成為凝膠保存在4 ℃冰箱備用；

4） 將瓊脂糖凝膠加熱至95 ℃左右，使其充分融化，瓊脂糖溶液設(shè)置三個(gè)鋪設(shè)量:35、45、55μL每孔，趁熱將瓊脂糖溶液加入到96孔板中，放入37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱備用；

2.瓊脂糖凝膠三維細(xì)胞培養(yǎng)

1）將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化下來(lái)，制成不同濃度的細(xì)胞懸液；

2）以1.975×104、 2.96×104、 4.444×104、 6.667×104、 1×105 個(gè)·mL- 1 每孔100 μL 接種于預(yù)處理的 96 孔板，每孔 100 μL 細(xì)胞懸液量接種于制備的瓊脂糖培養(yǎng)板底部凹面，1000 r·min- 1 離心 1 min 后放入培養(yǎng)箱，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)檢測(cè)；

3）細(xì)胞球體積

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，在倒置顯微鏡下拍攝細(xì)胞球照片，使用Image J測(cè)量細(xì)胞球的長(zhǎng)徑（Ra）與短徑（Rb），計(jì)算細(xì)胞球體積，并繪制細(xì)胞球體積——細(xì)胞接種數(shù)量曲線；細(xì)胞球體積計(jì)算公式：V=3.14xRa×Rb2/6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤細(xì)胞三維模型，其特征在于，所述培養(yǎng)板為96孔普通培養(yǎng)板；三維培養(yǎng)中，每孔瓊脂糖溶液量為30-60 μL；培養(yǎng)板中瓊脂糖濃度為1 %；細(xì)胞集中數(shù)為2000-6000個(gè)·孔- 1。

3.一種腫瘤細(xì)胞活力檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法為APH法檢測(cè)細(xì)胞活力，步驟如下：

1）細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，離心棄上清液，每孔加入 100 μL的APH反應(yīng)液（0.1 mol/L醋酸鈉、0.1 % Triton X-100、2 mg/mL 4-硝基苯基磷酸二鈉），37 ℃反應(yīng) 3 h；

2）反應(yīng)結(jié)束后每孔加入 20 μL的反應(yīng)終止液（1 mol/L NaOH），震蕩混勻，于酶標(biāo)儀在405 nm 處測(cè)定吸光度值A(chǔ)405。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種腫瘤細(xì)胞活力檢測(cè)方法，其特征在于，所述APH 法是基于胞質(zhì)酸性磷酸酶活性的定量方法，活細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶將 4-硝基苯基磷酸水解成 4-硝基苯酚；在 APH 反應(yīng)液中加入表面活性劑 TritonX 100，將細(xì)胞膜溶解，進(jìn)而充分釋放細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的酸性磷酸酶。