[發(fā)明專利]流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011308810.5
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112666062A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王兆豐;朱濤;林濤
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省榮軍醫(yī)院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64;G01N21/76;G01N33/58;G01N33/569
• 代理公司: 嘉興啟帆專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33253
• 代理人: 王大國

1.流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

S1、采集體液標(biāo)本；

S2、評估標(biāo)本質(zhì)量與數(shù)量；

S3、進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞群分類、多標(biāo)記免疫分型、細(xì)胞因子分析與腫瘤標(biāo)志物檢查；

S4、結(jié)果分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法，其特征在于：所述體液標(biāo)本包括但不限于為尿液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、透析液、陰道分泌液、穿刺組織塊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法，其特征在于：所述評估標(biāo)本質(zhì)量與數(shù)量，具體如下：

1)觀察采集時(shí)間，標(biāo)本采集后四小時(shí)內(nèi)送檢為符合條件的新鮮標(biāo)本；

2)觀察標(biāo)本采集量，樣本量大于10ml為符合條件標(biāo)本；

3)運(yùn)用希森美康全自動(dòng)模塊式血液體液分析系統(tǒng)XN-2000，選擇體液模式上機(jī)，若白細(xì)胞數(shù)大于100x10⁶/L，則為符合數(shù)量要求標(biāo)本。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法，其特征在于：所述常規(guī)細(xì)胞群分類，具體如下：

1)運(yùn)用希森美康全自動(dòng)模塊式血液體液分析系統(tǒng)XN-2000，選擇體液模式上機(jī)，獲得白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞五分類；

2)將體液標(biāo)本1300r/min離心5分鐘后，去上清，將沉渣涂片瑞姬氏染色后，生物顯微鏡下觀察分類計(jì)數(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法，其特征在于：所述多標(biāo)記免疫分型，具體如下：

1)將體液標(biāo)本1300r/min離心5分鐘后，去上清，加2mlPBS,混勻，1300r/min離心5分鐘，去上清，重復(fù)洗3次后留沉渣；

2)取三管流式管，其中1號試管包括標(biāo)本沉渣50ul，熒光抗體FITC-CD3 20ul、PE-CD16/56 20ul、PerCP-CD45 20ul、PE-CY7-CD8 5ul、APC-CD19 5ul、APC-CY7-CD4 5ul；2號試管包括標(biāo)本沉渣50ul，熒光抗體FITC-CD7 20ul、PE-CD117 20ul、PE-CY7-CD19 5ul、APC-CD25ul、APC-CY7-CD45 5ul；3號試管包括標(biāo)本沉渣50ul，熒光抗體FITC-CD45RA 20ul、PE-CD3420ul、PerCP-CD5 20ul、PE-CY7-CD13 5ul、APC-CD45RO 5ul、APC-CY7-CD14 5ul,混勻，避光靜置15分鐘，加2ml特殊破膜劑，破膜劑包括二甘醇30％-50％、甲醛20％-30％、甲醇30％-40％混合液，混勻，避光靜置10分鐘，1300轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，加2mlPBS，混勻，1300轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，加1號3號試管加500ulPBS，2號試管加500ul特殊染料，混勻；

3)運(yùn)用BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀BD FACSDiva Software軟件進(jìn)行分析，設(shè)定不同的橫縱坐標(biāo)通道標(biāo)記獲取兩兩標(biāo)記物之間的關(guān)系圖，調(diào)整儀器電壓及補(bǔ)償，使得儀器到達(dá)合適的工作條件，從而獲得不同標(biāo)記所示細(xì)胞群的數(shù)量及是否存在異常細(xì)胞；

4)將在BD FACSDiva Software軟件中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，運(yùn)用ModFit LT4.1分析軟件導(dǎo)入含有PI染料的實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，1號門圈中分析的所有細(xì)胞，減少細(xì)胞碎片，2號門設(shè)定縱坐標(biāo)為SSC-A，橫坐標(biāo)為APC-CY7-CD45，圈住部分細(xì)胞群反復(fù)分析，觀察是否存在異常細(xì)胞群。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的流式細(xì)胞術(shù)在體液細(xì)胞免疫分析中聯(lián)合檢測的方法，其特征在于：所述反設(shè)門技術(shù)，具體如下：將在ModFit LT4.1分析軟件檢測到的異常細(xì)胞峰及框內(nèi)異常細(xì)胞群，在BD FACSDiva Software軟件中選擇同樣橫縱坐標(biāo)選擇同樣位置細(xì)胞群P9。