[發明專利]一種腈水合酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202011307426.3
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112322606B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 周哲敏;郭軍玲;江詩進;程中一;劉中美;崔文璟;周麗;韓來闖
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種腈水合酶突變體及其應用，屬于基因工程和酶工程領域。本發明提供的腈水合酶突變體Str.t NHase?βL48D在65℃的半衰期大約是43分鐘，相比其他NHase酶熱穩定性有顯著提高。采用本發明的技術方案，對于以煙腈、丙烯腈、苯甲腈、2?氰基吡嗪腈、異丁腈、正戊腈、肉桂腈等腈類化合物為底物的反應，其底物耐受性得到了明顯的提高。

技術領域

本發明涉及一種腈水合酶突變體及其應用，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

腈水合酶(NHase)可用于催化3-氰基吡啶生成藥用價值更高的尼克酰胺，尼克酰胺又名煙酰胺，是一種維生素，已經被廣泛的用于飼料、食品、制藥等行業。煙酰胺市場需求量很大，預計每年需要2000多噸，但目前我國尼克酰胺的生產水平不高，規模不大，需要大量的進口，約1000噸/年。因此，將NHase用于尼克酰胺的生產有很大潛力。但是，該反應是一個放熱的過程，所以生產過程中高溫會影響酶活的發揮，主要是溫度高，影響酶的結構，導致酶活下降，進而導致了大量的能耗，提高了生產成本。目前工業生產中主要用玫瑰色紅球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成煙酰胺，采用的是底物分批補料的方式，但是紅球菌生長周期較長，生產效率不高，煙酰胺產量最高為162g/L，而丙烯酰胺產量最高為300g/L。目前也有通過重組菌生產煙酰胺的報道，但終產物濃度較低，只有240g/L。

腈水合酶的不穩定性還體現在對底物(腈類有機物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活；例如在丙烯酰胺的酶法制備過程中，由于腈水合酶對底物的耐受性不高，導致終產物丙烯酰胺只能維持較低的水平，給后續的丙烯酰胺濃縮工藝帶來影響。隨著市場的不斷拓展，酰胺類化合物的需求也日益劇增，因此如何提高腈水合酶的底物耐受性已成為研究重點。獲得一株有底物耐受性好、催化效率高的腈水合酶對于酰胺類工業化生產具有重要的應用價值。

發明內容

本發明旨在提供一種穩定性、酶活都提高的腈水合酶突變體并構建可以高性能催化多種腈類底物的酶工具箱。

本發明首先提供了一種腈水合酶突變體，所述突變體為(1)-(5)任一：

(1)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基的第37位亮氨酸突變得到的；

(2)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基第41位苯丙氨酸突變得到的；

(3)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基第46位酪氨酸突變得到的；

(4)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基第48位亮氨酸突變得到的；

(5)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基第51位苯丙氨酸突變得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體為(1)-(5)任一：

(1)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基的第37位的亮氨酸分別突變為脯氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一種得到的，分別命名為：βL37P，βL37K，βL37D，βL37A，βL37F；

(2)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基第41位的苯丙氨酸分別突變為脯氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的一種得到的，分別命名為：βF41P，βF41K，βF41D，βF41A；

(3)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亞基第46位的酪氨酸分別突變為脯氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一種得到的，分別命名為：βY46P，βY46K，βY46D，βY46A，βY46F；