[發明專利]一種導致先天性耳聾的CRISPR/Cas9系統及其在制備模型豬核供體細胞中的應用在審
| 申請號： | 202011304451.6 | 申請日： | 2020-11-19 |
| 公開（公告）號： | CN112522264A | 公開（公告）日： | 2021-03-19 |
| 發明（設計）人： | 牛冬;汪滔;馬翔;曾為俊;王磊;程銳;陶裴裴;趙澤英;劉璐;黃彩云 | 申請（專利權）人： | 南京啟真基因工程有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/62;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 南京天華專利代理有限責任公司 32218 | 代理人： | 傅婷婷;徐冬濤 |
| 地址： | 211306 江蘇省南京市高淳區經*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 導致 先天性 耳聾 crispr cas9 系統 及其 制備 模型 供體 細胞 中的 應用 | ||
1.一種用于TMC1基因編輯的sgRNA靶點，其特征在于序列如SEQ ID NO：21所示。
2.一種用于TMC1基因編輯的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO：25所示。
3.一種針對豬TMC1基因的gRNA表達載體，其特征在于以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA為載體骨架，表達權利要求2所述的gRNA。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于將SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示的單鏈DNA退火得到的具有粘性末端的雙鏈DNA分子插入載體骨架pKG-U6gRNA的BbsI限制性內切酶位點所得。
5.一種用于豬TMC1基因編輯的CRISPR/Cas9系統，其特征在于包含Cas9表達載體和權利要求3或4所述的針對豬TMC1基因的gRNA表達載體。
6.根據權利要求5所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于所述的Cas9表達載體為質粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO載體。
7.根據權利要求6所述的CRISPR/Cas9系統，其特征在于所述的gRNA表達載體和Cas9表達載體的摩爾比為1～3:1，進一步優選3:1。
8.權利要求5～7中任一項所述的CRISPR/Cas9系統在構建先天遺傳性耳聾克隆豬核供體細胞中的應用。
9.一種重組豬成纖維細胞，其特征在于由權利要求5～7中任一項所述的CRISPR/Cas9系統共轉染豬原代成纖維細胞經驗證后所得。
10.權利要求9所述的重組細胞在構建TMC1基因敲除的克隆豬中的應用；優選在構建TMC1基因敲除的先天遺傳性耳聾克隆豬中的應用。
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