[發明專利]一種水稻稻瘟病抗性改良的育種方法

在審

• 申請號: 202011304418.3
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112391407A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 彭強;李佳麗;張大雙;吳嫻;朱速松
• 申請（專利權）人: 貴州省水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/6895
• 代理公司: 貴陽易博皓專利代理事務所(普通合伙) 52116
• 代理人: 田常娟

1.一種水稻稻瘟病抗性改良的育種方法，其特征在于，包括：

根據水稻稻瘟病抗病基因的抗病機理，選擇功能缺失產生抗性的廣譜抗性基因Pi21和Pid3；

選擇所述基因Pi21和Pid3的基因編輯位點，并擴增抗病基因的U3或U6 RNA啟動子，構建單基因雙靶點或雙基因四靶點的CRISPR/Cas9載體；

以目標水稻品種為遺傳受體，將CRISPR/Cas9載體導入愈傷組織，通過抗性篩選和分化培養得到T0代轉基因植株；

檢測所述T0代轉基因植株的檢測子代植株是否含有Cas9外源DNA；

篩選功能基因敲除的突變株系，并且擴增突變株系的靶位點DNA，TA克隆測序得到DNA突變信息；

在后代中篩選不含Cas9外源DNA的，并且抗病基因Pi21或Pid3發生純合突變的改良株系。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，選擇所述基因Pi21和Pid3的基因編輯位點包括：

確定適用于水稻基因突變gRNA序列，利用 NCBI 對水稻基因組進行 BLAST 來分析確認靶位點的特異性，排除潛在脫靶序列；其中，靶點接頭引物為Pid3-U3-F/R和/或Pid3-U6a-F/R。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，擴增抗病基因的U3或U6 RNA啟動子，構建單基因雙靶點或雙基因四靶點的CRISPR/Cas9載體包括：

將所連接好的載體通過熱激法轉入大腸桿菌DH 5α中，挑斑搖菌后抽提質粒，進行PCR擴增，確認載體無誤后轉入農桿菌EHA 105感受態細胞中。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將CRISPR/Cas9載體導入愈傷組織包括：

采用組織培養和農桿菌介導將CRISPR/Cas9載體導入愈傷組織。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，采用組織培養和農桿菌介導將CRISPR/Cas9載體導入愈傷組織包括：

采用電擊法轉化農桿菌，將含有基因編輯系統的菌液轉化到大粒香愈傷組織中。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過抗性篩選和分化培養得到T0代轉基因植株包括：

采用質量濃度50 mg/L潮霉素進行篩選，通過共培養、水洗、篩選、預分化、分化、生根獲得再生組培苗，之后移栽到土壤中，在溫室內進行培養得到所述T0代轉基因植株。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，篩選功能基因敲除的突變株系，并且擴增突變株系的靶位點DNA包括：

取成活再生苗的葉片，抽提葉片組織DNA，設計載體引物SP-ML/R進行陽性鑒定，分別在Pid3靶序列兩側設計擴增引物CRd3-F/R來擴增T0代陽性植株的目的條帶。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，擴增條件為：95℃變性45 秒，57℃退火40秒，72℃延伸70 秒，32個循環，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其特征在于，在后代中篩選不含Cas9外源DNA的，并且抗病基因Pi21或Pid3發生純合突變的改良株系包括：

將T0代突變的crispr-pid3雙靶點材料，自交獲得T1代種子，提取DNA用載體引物SP-ML/R擴增T1代突變體基因組序列，擴增不出條帶的為無轉基因成分的突變體植株。

10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：

田間稻瘟病鑒定和農藝性狀拷種鑒定稻瘟病抗性改良株系。