[發明專利]松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202011304249.3
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112481386A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 于海英;張靜;黃瑞芬;張歆逢
• 申請（專利權）人: 南京耐德高科技有限公司;國家林業和草原局森林和草原病蟲害防治總站
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 劉省超

1.松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒，其特征在于：包括Q-PCR凍干粉、復溶液和核酸提取試劑，所述Q-PCR凍干粉包含擴增酶1-2U、引物100-500nM、探針100-500nM、KCl20-30mM、MgSO4 2-10mM，所述復溶液包含Tris-HCl 10-20mM，所述核酸提取試劑包含Tris-Hcl 50-200mM、EDTA 10-30mM、NaCl200-500mM、SDS 1-3％，所述引物、探針序列如下：

引物F：CCTATGACACATTTATTCGTGCTCGTC

引物R：CGGCAAGCAGCTGGCTG

探針P：FAM--GGAACGACGCGAATCGAACCG--BHQ1。

2.松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)利用所述核酸提取試劑從松材線蟲疫木木屑樣本和線蟲液樣本中提取松材線蟲基因組DNA；

(2)將通過所述步驟(1)提取的松材線蟲基因組DNA作為擴增模板，加入到所述松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒中，設置反應程序進行擴增檢測；

(3)使用熒光檢測設備對通過所述步驟(2)的擴增檢測結果進行熒光判讀。

3.根據權利要求2所述的松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)的松材線蟲基因組DNA通過以下步驟得到：

取100mg左右的疫木木屑樣本到1.5mL的Eppendorf管中，加入1mL核酸提取試劑，10,000rpm離心30秒，95℃處理5-20分鐘，得到的裂解液即為松材線蟲基因組DNA擴增模板。

4.根據權利要求2所述的松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)的松材線蟲基因組DNA通過以下步驟得到：

取1mL的線蟲液樣本到1.5mL的Eppendorf管中，10,000rpm離心1分鐘，棄去上清加入100uL核酸提取試劑，95℃處理5-20分鐘，得到的裂解液即為松材線蟲基因組DNA擴增模板。

5.根據權利要求2所述的松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)具體為：

取通過所述步驟(1)制得的松材線蟲DNA擴增模板5ul加入到所述松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒20ul反應體系中，反應程序：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；40個循環，FAM通道檢測熒光。

6.根據權利要求2所述的松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中熒光檢測設備需要激發波長497nm，檢測波長520nm。

7.松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒的用途，其特征在于：所述松材線蟲核酸檢測常溫型快速PCR試劑盒用于單條及以上松材線蟲的檢測。