[發明專利]一種轉基因甘蔗SCAG2的T-DNA側翼序列及其轉化事件特異性鑒定方法

在審

• 申請號: 202011303537.7
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112375838A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 馮翠蓮;張樹珍;萬玥;王俊剛;馮小艷;趙婷婷;王文治;沈林波
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 張新蕊

本發明公開了一種轉基因甘蔗SCAG2的T?DNA側翼序列及其轉化事件特異性鑒定方法。所述的轉基因甘蔗SCAG2的T?DNA側翼序列，其包含核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的左側翼序列和/或核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示的右側翼序列。本發明首次擴增得到轉基因甘蔗SCAG2外源基因插入位點的左右側翼序列，以此序列為基礎，建立了轉基因甘蔗SCAG2的事件特異性檢測方法，該方法特異性好，靈敏度高，轉基因成分相對含量0.1％及以上時利用常規定性PCR方法即可檢測，靈敏度遠高于歐盟對轉基因植物衍生的食品及飼料標識的0.9％的最低限量，為轉基因甘蔗SCAG2的利用及產品檢測提供關鍵技術基礎。

技術領域

本發明涉及轉基因甘蔗領域，具體涉及一種轉基因甘蔗SCAG2的T-DNA側翼序列及其轉化事件特異性鑒定方法。

背景技術

甘蔗(Saccharum spp.)是全球第五大宗農作物，是世界上最重要糖料和生物燃料作物。中國糖業協會數據顯示：2020年全國種植甘蔗119.1萬公頃，產糖量為841.9萬噸，農業直接年產值約480億人民幣，因此甘蔗產業對國民經濟經濟具有重要的意義。然而甘蔗各種螟蟲的為害，嚴重影響甘蔗的產量和質量，僅以湘桂蔗區為例，2018-2019年，該區的甘蔗蟲害發生極為嚴重，平均螟害株率高達46.54％，平均產量損失為14.87％，平均蔗糖分損失高達1.12個百分點，農業損失4.67億元，工業損失8.56億元，國家財政損失0.51億元。因此培育抗蟲甘蔗新種質一直是甘蔗育種的一個重要目標，然而甘蔗是高度雜合的無性繁殖作物，其龐大的基因組、復雜的高多倍體以及同源異源雜交品種等復雜的遺傳背景，給育種工作帶來很大的盲目性。基因工程可以定向改變作物的某些性狀，通過轉基因技術提高甘蔗抗蟲性將是甘蔗抗蟲育種的重要新途徑。

然而在轉基因作物中，T-DNA在受體植物基因組中的整合位置都是隨機的，每個轉基因事件的T-DNA左右端序列與受體基因組序列拼接而成的T-DNA插入位點側翼序列是唯一的，是該轉基因事件身份的特異性標識。因此，分離轉基因植物的T-DNA側翼序列，以及依據該側翼序列而建立的特異性檢測方法，是準確識別不同轉基因作物，實現轉基因作物及其產品產權保護、檢測和有效監督管理的一個重要依據。

目前分離外源T-DNA側翼序列主要以PCR技術為基礎，包括反向PCR、外源接頭介導PCR、半隨機引物PCR、全基因組重測序技術等，其中半隨機引物PCR中的熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)、高效熱不對稱PCR(hiTAIL-PCR)或染色體步移法(Genome Walking)是當前使用最廣泛的方法。利用此類技術已經成功分離了轉基因水稻、大豆、棉花、玉米、小麥、馬鈴薯、油菜和木瓜等T-DNA側翼序列，并建立其相應的轉化事件特異性檢測技術；全基因組重測序是近年發展起來的新技術，是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，該技術也成功應用到分離轉基因作物大豆、水稻的T-DNA側翼序列上，并建立其相應的轉化事件特異性檢測技術。轉基因作物轉化事件特異性檢測技術是以其轉基因T-DNA側翼序列的部分序列為靶標進行擴增，擴增產物是T-DNA 5’端或3’端序列與受體基因組的拼接序列，因此具有高度特異性，可準確識別不同的轉基因作物品系。

本研究組前期通過農桿菌介導把Cry1Ac-2A-gna抗蟲融合基因轉入甘蔗新臺糖22號，經過2個無性繁殖世代的抗蟲性和遺傳穩定性的評價和深入農藝性狀鑒定，已獲得抗蟲性好農藝性狀優良的SCAG2株系，正準備進行下一階段的環境釋放試驗。為了明確轉基因甘蔗SCAG2的分子特征及便于其檢測，推進其的生物安全性評價工作，本實驗以其無性繁殖T2代為植物材料，首先利用Southern雜交檢測外源T-DNA在SCAG2中的插入拷貝數；然后利用染色體步移技術分離其T-DNA側翼序列，并根據T-DNA左右端序列和左右側翼序列設計檢測引物，建立轉基因甘蔗SCAG2的轉化事件特異性檢測方法，同時檢驗該方法的特異性與靈敏度，為該轉基因甘蔗及其衍生產品的檢測和身份識別提供技術依據。

發明內容