[發明專利]基于溶劑誘導蛋白沉淀探測配體與蛋白相互作用或親和力的方法

有效

• 申請號: 202011301244.5
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112824905B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 葉明亮;張曉磊;胡良海
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種基于溶劑誘導蛋白沉淀探測配體與蛋白相互作用的方法，其特征在于，該方法利用蛋白結合配體后對溶劑誘導變性而導致沉淀的耐受能力不同而建立;配體組和對照組的蛋白溶液分別加入等量的溶劑使蛋白沉淀，然后利用定量技術對配體組和對照組中保持溶解蛋白或沉淀的各個蛋白的濃度進行監測，通過比較配體組和對照組中蛋白沉淀的差異，篩選出配體結合靶標蛋白；

該方法包括：

（a）將一系列濃度，選擇配體5個不同終濃度點或6個以上不同終濃度點，其中一個濃度點為無配體的對照點,即配體終濃度為0的對照組的同一種配體與待檢蛋白溶液分別進行孵育；

（b）在含有蛋白和配體的混合物中加入一定劑量的溶劑進行沉淀蛋白；

（c）分別檢測含有蛋白和配體混合物的上清液和/或沉淀中各個蛋白的豐度；

（d）以橫坐標為不同藥物濃度，縱坐標為蛋白豐度擬合曲線并通過計算得到半最大效應濃度值，concentration for 50% of maximal effect，EC50，獲得配體與靶標蛋白之間的結合強度信息即親和力；其中計算方程：Y=min+(max-min)/(1+10^((Log EC50-X)*HillSlope)），Y為縱坐標蛋白豐度，X 為不同的藥物濃度，min和max分別為Y軸對應蛋白豐度的最小值和最大值，Hill Slope指的是曲線最大斜率的絕對值即曲線中點。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法的步驟為：

（a）于待檢蛋白溶液中加入配體，作為配體組；不加入配體的待檢蛋白溶液，作為對照組；分別孵育；

（b）在上述兩組混合物中分別加入等量溶劑誘導蛋白部分沉淀；

（c）檢測蛋白混合物上清液和/或沉淀中各個蛋白的豐度；

（d）比較配體組和對照組中蛋白豐度的差異確定配體靶標蛋白。

3.一種基于溶劑誘導蛋白沉淀檢測配體與蛋白之間親和力的方法,該方法包括：

（a）將一系列濃度，選擇配體5個不同終濃度點或6個以上不同終濃度點，其中一個濃度點為無配體的對照點,即配體終濃度為0的對照組的同一種配體與待檢蛋白溶液分別進行孵育；

（b）在含有蛋白和配體的混合物中加入一定劑量的溶劑進行沉淀蛋白；

（c）分別檢測含有蛋白和配體混合物的上清液和/或沉淀中各個蛋白的豐度；

（d）以橫坐標為不同藥物濃度，縱坐標為蛋白豐度擬合曲線并通過計算得到半最大效應濃度值，concentration for 50% of maximal effect，EC50，獲得配體與靶標蛋白之間的結合強度信息；其中計算方程：Y=min+(max-min)/(1+10^((Log EC50-X)*Hill Slope)），Y為縱坐標蛋白豐度，X 為不同的藥物濃度，min和max分別為Y軸對應蛋白豐度的最小值和最大值，Hill Slope指的是曲線最大斜率的絕對值即曲線中點。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，進行步驟C檢測之前，采用離心將可溶性蛋白與沉淀蛋白進行分離。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，蛋白溶液包括一種蛋白或二種以上蛋白混合物；蛋白混合物包括細胞或組織提取液中的一種或兩種以上; 細胞或組織提取液來源于人、動物、植物或細菌中的一種或兩種以上。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，蛋白溶液包括血液或血漿中的一種或兩種以上；血液或血漿來源于人或動物中的一種或兩種。

7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，蛋白溶液是采用使細胞或組織中的一種或兩種以上中的蛋白保持天然構象的提取條件；

提取條件：采用磷酸鹽緩沖溶液phosphate buffer saline，PBS或加入含有體積百分比0.2-0.4％乙基苯基聚乙二醇Nonidet P 40的PBS作為緩沖液，并結合2-5次的反復的凍融過程提取，凍融過程為液氮冷凍和10-50℃融化。