[發(fā)明專利]同時(shí)檢測辣椒四種病毒的多重RT-PCR引物組及其方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011300057.5
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112195288A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔明霞;王日升;趙虎;王萌;吳星;趙曾菁;何志;黃金梅
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 南寧市吉昌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 45125
• 代理人: 滕藝瓊

1.一種同時(shí)檢測辣椒四種病毒的多重RT-PCR引物組，其特征在于，所述引物組包括CMV引物對、CHiVMV引物對、PVMV引物對和PMMoV引物對，引物對CMV-F和CMV-R為檢測黃瓜花葉病毒(CMV)的引物，產(chǎn)物片段大小為682bp；引物對CHiVMV-F和CHiVMV-R為檢測辣椒脈斑駁病毒(CHiVMV)的引物，片段大小為923bp；引物對PVMV-F和PVMV-R為檢測甜椒葉脈斑駁病毒(PVMV)的引物，片段大小為823bp；引物對PMMoV-F和PMMoV-R為辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)的引物，片段大小為990bp，具體如下：

CMV-F：GGTTCTGGAAAACACAGGTTCA，如SEQ ID NO.1所示；

CMV-R：GAGTCATGGACAAATCTGAATCAAC，如SEQ ID NO.2所示；

CHiVMV-F：ATAATTTGTCCCAACCACCTGA，如SEQ ID NO.3所示；

CHiVMV-R：CTCACAAGCATTAACACAGAGC，如SEQ ID NO.4所示；

PVMV-F：GGTGTGTAAATGATTTCGGC，如SEQ ID NO.5所示；

PVMV-R：GAAAAAGTGAGAGCCAGTTAG，如SEQ ID NO.6所示；

PMMoV-F：TCCGAGAAGTGCCGACAC，如SEQ ID NO.7所示；

PMMoV-R：TCAATTTGTCTGCCGCTGA，如SEQ ID NO.8所示。

2.一種包含如權(quán)利要求1所述多重RT-PCR引物組的試劑或試劑盒。

3.一種采用如權(quán)利要求1所述的多重RT-PCR引物組檢測辣椒CMV、CHiVMV、PVMV及PMMoV四種病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

(1)辣椒植株葉片RNA的提取：取田間帶病毒癥狀的辣椒幼嫩葉片，液氮中保存，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，用如上所述的4對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)PCR產(chǎn)物凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，根據(jù)目的片段大小及陽性對照，判斷病毒感染情況。

4.根據(jù)如權(quán)利要求3所述的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR的反應(yīng)體系25.0μL，包括2×Taq PCR Mix反應(yīng)液12.5μL、cDNA模板3.0μL、黃瓜花葉病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒脈斑駁病毒正向引物和反向引物各0.3μL、甜椒葉脈斑駁病毒正向引物和反向引物各0.3μL、辣椒輕斑駁病毒正向引物和反向引物各1.0μL、超純水補(bǔ)至所需體積。

5.根據(jù)如權(quán)利要求3所述的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于：所述PCR的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；30個(gè)循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃2min。