[發(fā)明專利]合成α-熊果苷的基因工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011298565.4
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號(hào): CN112300977A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉龍;呂雪芹;陳堅(jiān);堵國成;李江華
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12N15/63;C12P19/44;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

1.一種合成α-熊果苷的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株是在枯草芽孢桿菌宿主中，以P43為啟動(dòng)子，異源表達(dá)蔗糖磷酸化酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的異源表達(dá)為游離表達(dá)或整合表達(dá)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的游離表達(dá)是以pP43NMK-P43質(zhì)粒為載體進(jìn)行表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的整合表達(dá)是將連接有P43啟動(dòng)子的蔗糖磷酸化酶基因片段整合至整合位點(diǎn)ganA基因上。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600、枯草芽孢桿菌B.subtilis 168或枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800。

7.一種權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將蔗糖磷酸化酶基因連接至含有P43的質(zhì)粒上獲得含有蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體，或?qū)43基因片段與蔗糖磷酸化酶編碼基因片段相連后融合至整合框獲得基因表達(dá)框，在表達(dá)框兩端加上待整合位點(diǎn)上下游同源臂獲得待同源重組的線性片段；

(2)將表達(dá)載體或線性片段轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)中，篩選得到所述的基因工程菌株。

8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基因工程菌株在全細(xì)胞催化合成α-熊果苷中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是將所述的基因工程菌株細(xì)胞作為催化劑，在25-35℃催化蔗糖和對苯二酚反應(yīng)生產(chǎn)α-熊果苷；其中，催化體系包含OD₆₀₀＝10-100的基因工程菌株細(xì)胞，250-350g/L蔗糖，40-60g/L對苯二酚。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因工程菌株細(xì)胞通過將所述的基因工程菌株接種至TB培養(yǎng)基中35-38℃培養(yǎng)10-15h得到。