[發(fā)明專利]靶向TNF-α的人源化納米抗體及其制備和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011297844.9
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112521498B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬興元;聶績凡;鄭文云;張佩文
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C07K16/24
• 分類號: C07K16/24;C07K16/00;C40B40/06;A61K39/395;A61P37/02
• 代理公司: 上海三和萬國知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31230
• 代理人: 侯佳猷

本發(fā)明提供一種靶向TNF?α的人源化納米抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1?SEQ ID NO:5任一所示。通過設(shè)計(jì)構(gòu)建了新型的人源化納米抗體的噬菌體庫，利用固相篩選法獲得了抗TNF?α的人源化納米抗體基因序列。隨后通過基因操作將納米抗體基因克隆至原核表達(dá)載體，利用BL21(DE3)中表達(dá)并獲得了較高的可溶性納米抗體蛋白。本發(fā)明制備的人源化納米抗體免疫原性小，穩(wěn)定性好，半衰期長，表達(dá)容易，偶聯(lián)其他分子容易，并可用于診斷/成像/示蹤和炎癥疾病的治療。因此，作為抗體藥物有著廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，更具體地講，涉及靶向TNF-α的人源化 納米抗體及其制備。

背景技術(shù)

TNF-α是一種主要由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，通過作用于TNFR 發(fā)揮功能。TNF-α成熟后在組織液中以二聚體，三聚體或五聚體等幾種狀態(tài)存 在，但只有三聚體具備生物活性。TNF-α結(jié)合TNFRΙ，激活TNFR1的胞內(nèi)死 亡結(jié)構(gòu)域，從而招募TNFR相關(guān)死亡蛋白(TNF receptor-associated death domain, TRADD)，TRAD又可招募相應(yīng)蛋白，一方面激活受體相互作用蛋白R(shí)IP，誘 導(dǎo)NF-κB信號通路的激活；另一方面TRADD可結(jié)合活化Fas相關(guān)蛋白(Fas associated death domain protein,FADD)，活化后的FADD與前體Caspase-8或前體Caspase-10結(jié)合，使得前體發(fā)生自剪切激活，從而啟動(dòng)了Caspase信號通路 的級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞內(nèi)的功能蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生降解，致使細(xì)胞凋亡。 TNF-α結(jié)合TNFRⅡ，引發(fā)受體多聚化，從而招募TNFR相關(guān)因子-2(TNF receptor associated factor,TRAF2)，激活NF-κB信號通路，暴露出NF-κB的核 定位序列，NF-κB分子由胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)抑或增強(qiáng)下游調(diào)控基因表達(dá)， 引發(fā)炎癥反應(yīng)。正常情況下，TNF-α的分泌在感染消退和啟動(dòng)組織修復(fù)過程中 起重要作用。但當(dāng)分泌異常時(shí)，它將觸發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，因此在例如類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎和克羅恩氏病等自身免疫性疾病，此外在腫瘤微環(huán)境，CDR-T治療和感 染COVID-19的炎癥反應(yīng)過程，也存在TNF-α的異常表達(dá)。

納米抗體是一類基于單域抗體片段(VHH)的可以用于治療的蛋白質(zhì)，是 已知的最小的能夠正常識(shí)別抗原的抗體片段。納米抗體來源于天然駱駝重鏈抗 體的重鏈可變區(qū)，保留了天然重鏈抗體的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能特質(zhì)。納米抗體能夠 由單一的基因編碼，能在幾乎所有的原核和真核宿主菌中表達(dá)生產(chǎn)，免疫原性 較低，固有毒性較低，非常穩(wěn)定。這些獨(dú)特的生物物理和藥理學(xué)性質(zhì)使得納米 抗體成為藥物開發(fā)的優(yōu)秀候選物。

目前，獲取特異性納米抗體主要有兩種方法天然文庫和免疫文庫。而天然 文庫以及免疫文庫由于需要?jiǎng)游镅夯蛘呙庖撸僮鞣爆崳瑯?gòu)建周期長且費(fèi)用 昂貴。而新型的合成文庫不需要?jiǎng)游镔Y源和免疫，可直接通過基因工程技術(shù)快 速構(gòu)建文庫，更加高效便捷。合成文庫利用CDR區(qū)引物隨機(jī)化或定制化策略 來實(shí)現(xiàn)文庫多樣性，其中以CDR3區(qū)隨機(jī)多樣化最為常見。目前隨機(jī)化CDR 區(qū)主要手段為簡并引物和三聯(lián)核苷酸密碼盒。三聯(lián)核苷酸密碼盒是通過高端儀 器按照設(shè)定的可變區(qū)各位置氨基酸比例，來合成CDR區(qū)引物，使文庫總體性 質(zhì)與天然文庫更加接近，文庫質(zhì)量比簡并引物類型的合成文庫高，但其要求數(shù) 據(jù)庫資源，且合成周期長，費(fèi)用昂貴，目前未被廣泛采用。常用的cAbBCII10 框架構(gòu)建的合成文庫，篩選得到的單域抗體，利用普通大腸桿菌表達(dá)時(shí)，在不 借助外加輔助條件的情況下上清中的表達(dá)量很少，而包涵體的復(fù)性常需耗費(fèi)大 量的時(shí)間和成本，同時(shí)抗體開發(fā)后期的人源化改造，會(huì)對抗體活性造成影響， 甚至完全喪失。基于此，本發(fā)明從源頭著手，綜合考慮人源化和可溶性表達(dá)， 設(shè)計(jì)了一種新的人源化駝?lì)悊斡蚩贵w合成文庫框架，然后構(gòu)建用于篩選人源化 納米抗體的噬菌體庫平臺(tái)，嘗試一種新型的獲取TNF-α人源化納米抗體的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于，提供一種靶向TNF-α的人源化納米抗體。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于，提供靶向TNF-α的人源化納米抗體的制備方 法。