[發(fā)明專利]合成高谷氨酸的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011297790.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-19
• 公開（公告）號(hào): CN114517173B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁其朋;趙妍;李雪琪;孫新曉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/54;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州德勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41128
• 代理人: 王莉

1.一種合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，包括：宿主菌和轉(zhuǎn)入該宿主菌的質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體中導(dǎo)入了編碼賴氨酸酮戊二酸還原酶、酵母氨酸脫氫酶和α-氨基己二酸半醛脫氫酶的基因，所述宿主菌為大腸桿菌BW25113菌株，所述賴氨酸酮戊二酸還原酶、酵母氨酸脫氫酶均來源于釀酒酵母，所述α-氨基己二酸半醛脫氫酶來源于紅球菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中敲除了編碼賴氨酸脫羧酶基因的ldcC和cadA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中包括編碼天冬氨酸激酶的lysC突變基因和編碼4-羥基-四氫二吡啶甲酸合酶的dapA突變基因，并且在所述lysC突變基因和dapA突變基因序列上游整合T7強(qiáng)啟動(dòng)子；其中，所述lysC突變基因是將lysC原始基因中的第352位蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔鰀apA突變基因是將dapA原始基因中的第118位組氨酸突變?yōu)槔野彼帷?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中同時(shí)還敲除了糖酵解途徑中編碼葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的基因pgi。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述宿主菌中還整合了谷氨酸棒桿菌中多功能酶的編碼基因ddh到大腸桿菌基因組的四氫二吡啶琥珀酰酶編碼基因dapD所在位置，并在ddh基因序列的上游整合T7強(qiáng)啟動(dòng)子。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述質(zhì)粒載體中還導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中編碼谷氨酸外排的基因MscCG。

7.一種權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)高谷氨酸的工程菌的構(gòu)建方法，包括步驟：

重組表達(dá)質(zhì)粒?將編碼賴氨酸酮戊二酸還原酶的基因、編碼酵母氨酸脫氫酶和編碼α-氨基己二酸半醛脫氫酶的基因連接至所述表達(dá)質(zhì)粒上進(jìn)行重組，獲得質(zhì)粒載體；

構(gòu)建工程菌?將所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到所述宿主菌中，得到生產(chǎn)高谷氨酸的工程菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)高谷氨酸的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組表達(dá)質(zhì)粒的步驟中還包括將過表達(dá)編碼谷氨酸外排的基因MscCG，同時(shí)連接至所述表達(dá)質(zhì)粒上進(jìn)行重組獲得所述質(zhì)粒載體。

9.一種權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)高谷氨酸的工程菌的應(yīng)用，其特征在于，按照體積比1%～5%的接種量，將上述生產(chǎn)高谷氨酸的工程菌接種到培養(yǎng)基中，在30℃～37℃、pH為5～8的條件下進(jìn)行發(fā)酵處理，制得高谷氨酸；所述培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生產(chǎn)高谷氨酸的工程菌接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，添加3～10?g/L的賴氨酸。