[發(fā)明專(zhuān)利]檢測(cè)DSH基因突變的擴(kuò)增引物、試劑盒及應(yīng)用及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011297428.9
• 申請(qǐng)日: 2020-11-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112322724A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬騫;陳義兵;孔祥東;車(chē)凌儀
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6883
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州意創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 41138
• 代理人: 張江森;張燕紅

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)DSH基因突變的擴(kuò)增引物、試劑盒及應(yīng)用及方法，設(shè)計(jì)了一組多重的引物，結(jié)合多重PCR技術(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段化后建庫(kù)，應(yīng)用Ion torrent PGM個(gè)體化基因組測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得ADAR1基因突變信息。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)對(duì)15個(gè)外顯子編碼區(qū)的同步擴(kuò)增富集，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，使每個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)其標(biāo)簽序列找回，實(shí)現(xiàn)多樣本、高通量化平行測(cè)序，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。本發(fā)明中設(shè)計(jì)優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)，采用30個(gè)PCR反應(yīng)可以在單管中同步擴(kuò)增獲得ADAR1基因全部外顯子序列及側(cè)翼內(nèi)含子序列，與芯片捕獲技術(shù)相比，該方法操作簡(jiǎn)單、成本更低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)遺傳性對(duì)稱(chēng)性色素沉著癥致病基因突變的擴(kuò)增引物、試劑盒及應(yīng)用及方法。

背景技術(shù)

遺傳性對(duì)稱(chēng)性色素異常癥，又稱(chēng)對(duì)稱(chēng)性肢端色素沉著、對(duì)稱(chēng)性點(diǎn)狀和網(wǎng)狀白斑病，是一種罕見(jiàn)的遠(yuǎn)端四肢色素沉著性皮膚病，呈常染色體顯性遺傳。臨床特征表現(xiàn)為肢端具有形狀和大小不規(guī)則的對(duì)稱(chēng)性色素沉著斑和色素減色斑疹，呈網(wǎng)狀圖案，有些面部可見(jiàn)散在的雀斑樣損害，通常于嬰兒期或童年期發(fā)病。患者的色素型皮損往往可以持續(xù)終身，日曬后累計(jì)加重。位于染色體1q11-1q12上11.6 cM區(qū)段上ADAR1基因被鑒定為是該病的致病基因，ADAR1基因編碼雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶，此酶可以將腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，破壞雙鏈RNA的穩(wěn)定性。ADAR1基因定位于1號(hào)染色體1q21.3，全長(zhǎng)約40kb，相對(duì)分子量為39000，包含15個(gè)外顯子，編碼1226個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)上，ADAR1基因編碼的蛋白包含有2個(gè)腺苷脫氨基酶（Z-alpha）區(qū)域、3個(gè)dsRNA結(jié)合區(qū)域（DRBM）、1個(gè)酶催化結(jié)構(gòu)區(qū)域（ADEAMc），分別對(duì)應(yīng)于第2外顯子，第2-7外顯子，第9-15外顯子。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)200種以上的ADAR1基因突變位點(diǎn)，突變方式包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變、剪切位點(diǎn)突變、單堿基插入/缺失變異等，其中以錯(cuò)義突變及無(wú)義突變最常見(jiàn)。該病具有高度遺傳異質(zhì)性，相同基因突變的不同患者發(fā)病齡、臨床表型、嚴(yán)重程度、進(jìn)展情況各不相同,且存在顯著的地區(qū)和人種差異。ADAR1基因檢測(cè)也有助于其直系親屬遺傳咨詢(xún)，并為再次生育產(chǎn)前檢測(cè)提供依據(jù)。

基因診斷有助于患者皮膚病理診斷、遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷等。大部分遺傳性對(duì)稱(chēng)性色素異常癥患兒在兒童期和青少年期發(fā)病，病情不斷加重直至影響皮膚美觀，同時(shí)，患者也非常關(guān)心兄弟姐妹以及后胎的健康問(wèn)題。患者遺傳學(xué)病因的確診，為孕育健康的下一代提供明確的遺傳咨詢(xún)服務(wù)。目前采用PCR擴(kuò)增外顯子及側(cè)翼有限區(qū)域序列結(jié)合DNA測(cè)序的方法可明確90%左右的患者，仍有10%左右的患者不能明確病因，因此亟需能夠特異性檢測(cè)ADAR1全長(zhǎng)基因的檢測(cè)方法。鑒于ADAR1外顯子與內(nèi)含子較多，并具有高度遺傳異質(zhì)性，一代測(cè)序技術(shù)通量太低，耗時(shí)耗力，無(wú)法滿(mǎn)足眾多基因的測(cè)序和多樣本的檢測(cè)。

第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)是對(duì)經(jīng)典測(cè)序技術(shù)的一次革命性的技術(shù)更新，又稱(chēng)為高通量測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、低成本的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣本、多個(gè)基因、多個(gè)外顯子的立體化檢測(cè)。其中，Life Technologies公司2010年推出的的Ion torrent PGM測(cè)序平臺(tái)是半導(dǎo)體芯片測(cè)序的代表，該技術(shù)在高密度分布的芯片微孔中固定DNA模板鏈，隨后依次摻入核苷酸ACGT，當(dāng)有配對(duì)的堿基摻入時(shí)，在DNA聚合酶的催化下，把4種dNTP中的一種聚合延伸到DNA鏈上完成延伸反應(yīng)，釋放出H+離子，導(dǎo)致反應(yīng)池中pH值發(fā)生變化，位于池下的離子感應(yīng)器收到此信號(hào)后，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，從而讀出DNA序列。與一代測(cè)序技術(shù)相比，Ion torrent PGM測(cè)序系統(tǒng)更簡(jiǎn)單、快捷，由于其檢測(cè)設(shè)備無(wú)需光學(xué)檢測(cè)和掃描系統(tǒng)，并且使用配套試劑為天然核苷酸和聚合酶，無(wú)需較為復(fù)雜的標(biāo)記熒光信號(hào)的染料，Ion torrent PGM測(cè)序技術(shù)可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，不需要片段化處理，采用標(biāo)簽技術(shù)，不需要對(duì)每個(gè)樣本單獨(dú)建庫(kù)，可以顯著提高檢測(cè)通量，降低單個(gè)樣品的檢測(cè)成本。目前還未有將多重PCR技術(shù)和Ion torrent PGM測(cè)序技術(shù)結(jié)合，并將其應(yīng)用于ADAR1基因檢測(cè)的研究。