[發(fā)明專利]一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法

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• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112500473A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設計）人: 李榮光
• 申請（專利權）人: 李榮光
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/14;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 11390
• 代理人: 胡闊雷

1.一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)粗肽的預處理

先將艾塞那肽粗肽進行自然晾干，使其切割過程中殘留的溶劑揮發(fā)，晾干后將粗粗肽溶解后利用高效液相色譜儀進行粗肽分析，根據粗肽的分析圖譜可以知道艾塞那肽的出峰濃度以及雜質的分布情況；

(2)溶樣

按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18mL去離子水：2mL乙腈將經過自然晾干的艾塞那肽粗肽超聲溶解，超聲時間為5-10min，溶解完全后用濾膜進行過濾，收集濾液；

(3)粗純

利用反向液相色譜法對濾液進行粗純，色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相A1是體積分數0.05％-0.2％的磷酸水溶液，流動相B1是體積分數0.05％-0.2％磷酸的乙腈溶液進行梯度洗脫，分段收集粗純后的艾塞那肽溶液取小樣進行分析，將其中純度大于90％的一段溶液收集待用；

(4)離子交換

將步驟(3)中粗純后收集的溶液進行離子交換，填料為SP高流速瓊脂糖微球的強陽離子交換柱，流動相A2為0.02mol/L pH值為3.5～4.4的醋酸-醋酸鈉水溶液，流動相B2為含有0.5mol/L氯化鈉的0.02mol/L pH值為3.5～4.4的醋酸-醋酸鈉水溶液進行梯度洗脫，分段收集粗純后的艾塞那肽溶液取小樣進行分析，將其中純度大于95％的一段溶液收集待用；

(5)換鹽

將步驟(4)得到的溶液用反相高效液相色譜法進行換鹽，流動相A3為0.5mol/L的醋酸銨水溶液pH為3.8-4.8，流動相A是體積分數0.2％的醋酸水溶液，流動相B3為純乙腈，進行梯度洗脫，分段收集粗純后的艾塞那肽溶液取小樣進行分析，將其中純度大于98％的一段溶液收集待用；

(6)凍干

將步驟(5)中得到的純度達到98％以上部分的溶液收集起來進行濃縮，濃縮后得到的濃縮液進行凍干。

2.根據權利要求1所述的一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，步驟1中粗品分析的流動相A為0.1％的磷酸水溶液，流動相B為0.1％的乙腈溶液，分析時間為20分鐘，流動性相A的梯度是5-95，流動相B的梯度是95-5。

3.根據權利要求1所述的一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，步驟2中過濾的濾膜為0.45um的水系濾膜。

4.根據權利要求1所述的一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，步驟3中粗純的時間為0-40分鐘，洗脫梯度是流動相A相20-50，流動相B相80-50。

5.根據權利要求1所述的一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，步驟4中的離子交換的洗脫時間為0-40分鐘，流動相A相為30-70，流動相B相為70-30。

6.根據權利要求1所述的一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，步驟5中色譜柱填料是十八烷基硅烷鍵合硅膠，洗脫時間為60分鐘，前30分鐘A3:B3按95：5的梯度進行等度洗脫，后30分鐘A4相20-50，B3相為80-50進行梯度洗脫。

7.根據權利要求1所述的一種醋酸艾塞那肽的分離純化方法，其特征在于，步驟(6)收集的純度大于98％艾塞那肽溶液減壓濃縮至2-6g/mL后轉至凍干盤中凍干。