[發明專利]一株本土釀酒酵母YT28及其在馬瑟蘭葡萄酒釀造中的應用

在審

• 申請號: 202011296743.X
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112280695A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 黃衛東;郭思江;戰吉宬;陳穎;游義琳
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C12G1/022;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.保藏編號為CGMCC No.20633的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

2.如權利要求1所述的釀酒酵母及其在馬瑟蘭葡萄酒釀造中的應用。

3.一種生產葡萄酒的方法，是利用如權利要求1所述的釀酒酵母發酵馬瑟蘭葡萄原料，得到葡萄酒。

4.如權利要求1所述的釀酒酵母的分離、純化和鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)挑選摘取完整成熟、無霉果爛果的成串葡萄樣品，樣品設置三個平行，每份葡萄樣品約1kg，保存于無菌袋中，當天采集的葡萄當天處理，無菌條件下將葡萄樣品除梗，挑選完整、成熟、無病變霉變的果粒收集于500mL三角瓶中，以藥匙在三角瓶內破碎葡萄，葡萄破碎后每瓶葡萄醪約400mL，添加亞硫酸1mL/L，攪拌均勻后以無菌封口膜封口，葡萄醪置于25℃條件下自然發酵；

(2)從自然發酵第0天開始，前7天每24h無菌條件下取樣一次，每次取1mL葡萄汁，以無菌水梯度稀釋至10^-7，選取合適的3個稀釋濃度各0.1mL，涂布于WLN鑒別培養基平板，28℃條件下倒置培養72h；之后在葡萄醪菌群動態和化學成分變化平緩的發酵后期，第10天、第12天和第20天再次取樣，挑選出菌落數為30-300個的平板，根據WLN鑒別培養基對酵母菌分類鑒別的方法，對不同特點的菌落進行分類、編號，記錄各類菌落特點及數目，并拍照存檔；

(3)菌落形態不同、出現時期不同的每類酵母中，挑選2-3株保存于YPD斜面培養基中，于4℃條件下保存，酵母初步篩選完成后，再次通過菌落形態對菌株進行純化，挑取單菌落以平板劃線法于WLN鑒別培養基平板上純化菌株，28℃條件下倒置培養72h，記錄每次純化后的菌落特點并拍照存檔，結合顯微鏡觀察菌株純度，每個菌株純化2-3次；純化后的酵母使用40％甘油凍存管于-80℃條件下保存，待分子鑒定；

(4)提前活化待測酵母，將其接種于YPD液體培養基，于28℃，150rpm條件下恒溫振蕩培養12h，離心后取酵母細胞待用；使用天根酵母基因組DNA提取試劑盒提取待測酵母基因組DNA；選用引物對對酵母rDNA基因5.8S ITS區進行PCR擴增，取擴增產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(5)PCR產物測序；

(6)通過美國國家生物技術信息中心網站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的BLAST工具搜索待測菌株目的序列，進行相似序列搜索，根據同源序列的相似性初步確定YT28菌株的種屬地位，同時校正測序圖譜；比較YT28與已知酵母菌對應序列的相似程度，相似度超過99％，并通過YT28在WLN鑒別培養基上的菌落形態和細胞顯微形態最終鑒定待測菌株的種屬地位。