[發明專利]一種無包被NK細胞體外擴增和培養方法

有效

• 申請號: 202011296155.6
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112391344B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 薛衛巍;謝海濤;鐘家煒;劉元甲
• 申請（專利權）人: 廣東先康達生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 東莞卓誠專利代理事務所(普通合伙) 44754
• 代理人: 朱鵬

本發明涉及細胞培養技術領域，具體涉及一種無包被NK細胞體外擴增和培養方法。一種無包被NK細胞體外擴增和培養方法，包括以下步驟：(1)分離血清和全血細胞；(2)滅活血清；(3)獲取單個核細胞；(4)重懸單個核細胞；(5)誘導NK細胞；(6)擴增NK細胞。本發明不需要包被，操作簡單，經過激活培養基培養和增殖培養基使得NK細胞能夠優勢生長，NK的流式含量和擴增倍數較高，能夠適用于NK細胞臨床實驗研究及大規模制備。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體涉及一種無包被NK細胞體外擴增和培養方法。

背景技術

腫瘤作為重大疾病一直困擾人類的健康。隨著醫學的進步，癌癥的治愈率、生存率都有顯著的改善，但目前仍然由于腫瘤的復雜性、多樣性、可變性和異質性，找不到一種更好的治療方法。目前醫療行業內對癌癥的治療方法有手術切除、化學療法及放射線療法，但對人體的損傷較大。而過繼性免疫療法引起靶向性突出、副反應較少、干預方式簡單等優點成為當今用于研究腫瘤治療的熱點，而且在臨床得到廣泛的應用。

NK細胞因其無MHC限制、腫瘤殺傷范圍廣、免疫響應速度快而成為過繼性免疫療法的突出細胞之一。NK細胞又稱自然殺傷細胞，NK細胞是除T、B細胞之外的第三類淋巴細胞，具有獨特功能的細胞亞群，是人體免疫細胞中的一種淋巴細胞，是先天免疫細胞的關鍵部分，被認為是機體控制腫瘤的發生、發展和轉移的主要效應細胞之一，也是機體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。

近年來，NK細胞抗腫瘤已經在美國和日本等國家進行了大量的臨床試驗，顯示了良好的應用前景。據國內外相關報道，體外擴增NK細胞的技術主要有三種：一是磁珠分選法，從單個核細胞得到純化的NK細胞，體外擴增；二是利用飼養層細胞培養NK細胞；三是直接利用因子刺激從外周血中擴增培養NK細胞。前兩種擴增NK細胞的方法在臨床上應用的安全性尚未得到驗證，且磁珠分選法成本價高、飼養層細胞用為腫瘤細胞存在一定的風險，因此這兩種方法多用于科研研究；第三種利用細胞因子刺激擴增培養NK細胞的方法安全性較好，臨床應用價值高，但需要激活因子包被，因其需要在冰箱或二氧化碳培養箱中孵育數小時，會導致操作不方便和增大染菌風險。因此，尋找一種成本低、無外源血清、無飼養層細胞、無需包被、操作簡單且擴增倍數高的NK細胞體外培養方法是很有必要的。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

發明內容

本發明目的在于為了克服目前NK細胞體外培養的成本高、使用外源血清、使用飼養層細胞、流式結果低、因包被操作繁瑣和增加染菌風險等因素，用IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、CD16單克隆抗體、HER2單克隆抗體提刺激誘導NK細胞，自體血清保證營養，再用含有IL-2、IL-15的無血清完全培養基擴增，得到大量高純度的NK細胞。

為實現上述目的，本發明提供了如下技術方案：

一種無包被NK細胞體外擴增和培養方法，包括以下步驟：

(1)分離血清和全血細胞：取50mL血液置于離心管中離心，獲得血清和全血細胞；

(2)滅活血清；

(3)獲取單個核細胞；

(4)重懸單個核細胞：第0d收集的單個核細胞，分出0.6-10×10⁷數量的細胞，用40mL含有10％血清的激活培養基重懸后，轉入培養瓶，置于37℃、5％CO₂的培養箱中培養；

(5)誘導NK細胞：第3d補加50mL含有10％血清的激活培養基；第5d補加100mL含有10％血清的激活培養基；