[發明專利]一種檢測黃牛MFN1基因CNV標記的方法及其應用

有效

• 申請號: 202011296046.4
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112359120B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 雷初朝;黃永震;李佳霄;徐嘉威;亐開興;張繼才;黃必志;陳寧博;賀花;文逸凡;楊鵬;姚治
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種檢測黃牛MFN1基因CNV標記的方法及其應用：以云嶺牛的血樣基因組DNA為模板，通過實時熒光定量PCR分別擴增MFN1基因CNV區域和參考基因BTF3的部分片段，根據2*log₂2^?ΔΔCt將定量結果分為插入型、缺失型和正常型，從而鑒定云嶺牛MFN1基因的拷貝數變異類型。與云嶺牛生長數據的關聯分析顯示，MFN1基因不同拷貝數對個體生長發育有顯著影響，其中缺失型個體的胸寬低于插入型個體。本發明在DNA水平上檢測與牛生長性狀密切相關的CNV標記，可作為生長性狀的標記輔助選擇的重要候選分子標記，快速建立遺傳資源優良的肉牛種群。

技術領域

本發明涉及家畜分子生物學檢測領域，具體涉及一種基于qPCR技術檢測牛MFN1基因CNV標記的方法。

背景技術

隨著基因組學和生物信息學等學科的發展，動物育種理論和技術正在發生重大變化，肉牛育種的方向由常規的表型選育向分子育種發展。目前，牛分子育種研究主要集中在以分子標記為基礎的標記輔助選擇方面。分子育種即分子標記輔助選擇(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良。在畜禽育種中，通過對與數量性狀緊密關聯的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。

拷貝數變異(Copy Number Variations,CNVs)作為一種基因組亞顯微水平結構變異，具體是指基因組DNA中較大片段的缺失或重復現象，涉及的片段大小在50bp到數Mb之間。全基因組范圍內尋找CNV的方法主要包括比較基因組雜交(CGH)、SNP芯片和重測序。CGH是基于微陣列技術的比較基因組雜交，通過在一張芯片上用標記不同熒光素的樣品(試驗樣本與對照樣本)同時進行雜交，可檢測試驗樣本基因組和對照樣本基因組間DNA拷貝數的變化。CGH芯片的探針覆蓋整個基因組，具有敏感度、準確度、分辨率高的特點，分析所得數據具有較高的可信度。然而CGH的分辨率在Mb水平，更小片段的拷貝數片段則不易檢出，同時CGH操作繁瑣，通量低、耗時長且成本昂貴，需要大量的模板DNA，不利于大范圍的推廣。SNP芯片不需要同時使用兩個樣本的DNA和探針進行雙雜交，僅使用單雜交就可以完成。它可以通過比較測試樣本的信號強度與其他個體的強度，確定每個位點的相對基因組拷貝數。新一代直接測序技術克服了雜交固有的一些缺點，不需要更多的背景知識和設計工作，應用配對測序可以鑒定出復雜的結構變化。

對于已確定的CNV的檢測，通常是采用基于PCR技術和雜交技術的一些方法。例如實時熒光定量PCR(qPCR)、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。qPCR根據所使用的熒光化學方法的不同，主要分為熒光染料嵌入法和熒光雜交探針法兩類。熒光染料嵌入法利用PCR反應體系中加入的過量的SYBR Green染料分子，能特異性地滲入DNA雙鏈并發射熒光信號，而游離的染料分子則僅有很低的熒光本底，從而確保信號的增加與PCR產物的增加同步，可通過檢測熒光信號的強度來反映基因組DNA的數量。通過對目的基因(具有拷貝數變異)及參考基因(無拷貝數變異)進行相對定量，根據2^-ΔΔCt方法統計檢測樣本候選基因的拷貝數。熒光染料嵌入法的優點是實驗成本低、無需設計合成探針、使用方便，可以檢測目的片段的絕對拷貝數。

線粒體融合蛋白(MFN1)基因調控細胞內線粒體外膜的融合，維持細胞中網狀線粒體的動態需要。線粒體融合蛋白在N末端含有保守的催化GTP結合結構域，并通過C末端跨膜結構域錨定到外膜，線粒體融合蛋白通過GTP水解的同型和異型相互作用介導外膜融合。線粒體是所有真核生物都不可或缺的雙層膜細胞器，大多數細胞中線粒體是高度動態的，且通過不斷的融合、分裂來維持動態平衡。有研究指出，線粒體的快速融合與分裂是消除細胞內不正常線粒體的一種機制。

MFN1基因在線粒體新陳代謝中起著重要的作用，然而MFN1基因在牛肌肉發育中的作用尚未有研究報道。

發明內容