[發(fā)明專利]一種提高ARMS-TaqMan Blocker體系特異性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011295471.1
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112375813A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊芳梅;徐紅梅
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥歐創(chuàng)基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 合肥律眾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34147
• 代理人: 趙娟

本發(fā)明公開了一種提高ARMS?TaqMan Blocker體系特異性的方法，將PCR抑制劑添加到PCR熒光定量檢測體系中。本發(fā)明首次將PCR抑制劑添加到PCR熒光定量檢測體系中，抑制劑對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的抑制作用，而對特異性擴(kuò)增不產(chǎn)生抑制，從而達(dá)到降低非特異的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤突變檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種提高ARMS-TaqMan Blocker體系特異性的方法。

背景技術(shù)

近年來，探針的非放射性標(biāo)記受到廣泛重視，同時得到迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于核酸序列測定、基因檢測以及疾病診斷等。ARMS技術(shù)是常用的熒光探針法，其基本原理是，如果引物的3’端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據(jù)已知點突變設(shè)計3條引物，其3’端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補(bǔ)，從而將有某種點突變的模板與正常模板區(qū)分開來。有時候為了提高特異性，會在體系中加入野生型模板擴(kuò)增阻斷劑(Blocker)，用以壓制野生型模板的擴(kuò)增，雖然這種方法在一定程度上可以壓制野生，但是由于缺乏準(zhǔn)確的Blocker設(shè)計軟件和有效的篩選規(guī)則，導(dǎo)致壓制效果不理想；另外，也可在ARMS引物的3’端倒數(shù)第二或第三個堿基處引入錯配堿基，但是引入錯配堿基通常會犧牲靈敏度。因此，常規(guī)ARMS-TaqMan Blocker系統(tǒng)一般很難同時做到靈敏度、特異性兼顧，常需要復(fù)雜繁瑣的優(yōu)化工作。

發(fā)明內(nèi)容

針對常規(guī)ARMS-TaqMan Blocker體系很難同時做到靈敏度、特異性兼顧的問題，本發(fā)明提供一種提高ARMS-TaqMan Blocker體系特異性的方法。

本發(fā)明保護(hù)一種提高ARMS-TaqMan Blocker體系特異性的方法，將PCR抑制劑添加到PCR熒光定量檢測體系中，PCR抑制劑可以為SDS、苯酚、乙醇、異丙醇、乙酸鈉、氯化鈉、EDTA或尿素。PCR抑制劑的添加量范圍為24-40mM，優(yōu)選32mM。

常規(guī)PCR反應(yīng)抑制劑原則上會對擴(kuò)增產(chǎn)生抑制，但對于ARMS體系來說，非特異擴(kuò)增的產(chǎn)物量是極微量的，而特異性產(chǎn)物占絕大部分。當(dāng)體系中加入一定量的PCR抑制劑之后，對特異性擴(kuò)增不產(chǎn)生抑制，而非特異本身受到Blocker的強(qiáng)烈壓制，本身含量較低，加入抑制劑之后，會被進(jìn)一步抑制。

本發(fā)明還保護(hù)上述提高ARMS-TaqMan Blocker體系特異性的方法在腫瘤突變檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次將PCR抑制劑添加到PCR熒光定量檢測體系中，抑制劑對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的抑制作用，而對特異性擴(kuò)增不產(chǎn)生抑制，從而達(dá)到降低非特異的目的。

附圖說明

圖1為E545K位點PCR抑制劑作用對比圖；

圖2為braf位點PCR抑制劑作用對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明的實施例是為了示例和描述起見而給出的，而并不是無遺漏的或者將本發(fā)明限于所公開的形式。很多修改和變化對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。選擇和描述實施例是為了更好說明本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，并且使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明從而設(shè)計適于特定用途的帶有各種修改的各種實施例。

說明：本發(fā)明使用的引物、探針、Blocker通過軟件TM Utility v1.3進(jìn)行熔點預(yù)測，各引物、探針、Blocker的序列信息見下表1，其中F/R表示引物、P表示探針、B表示競爭性抑制劑Blocker、FAM為熒光基團(tuán)、MGB為淬滅基團(tuán)、方框表示LNA修飾的堿基、PHO表示磷酸化修飾。

表1

實施例1E545K位點PCR抑制劑的作用

一、引物、探針、Blocker設(shè)計