[發(fā)明專利]一種大腸桿菌生產(chǎn)SUMO酶的發(fā)酵工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011293265.7
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112280766A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雍金貴;張倫;孫偉;韋偉洋
• 申請（專利權(quán)）人: 通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34160
• 代理人: 匡立嶺

1.一種大腸桿菌生產(chǎn)SUMO酶的發(fā)酵工藝，其特征在于：包括以下步驟；

第一步：菌種活化：取3支已滅菌的試管，試管內(nèi)裝有4ml LB培養(yǎng)基，并分別向3支試管接入10μL菌種和2μL卡那霉素，然后在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)；取出已滅菌的1.5mL EP管，并向EP管中加入500μL已滅菌的50％甘油；當(dāng)試管中培養(yǎng)物OD₆₀₀＝0.6-0.8時，取出試管，從試管中取出500μL培養(yǎng)物加入至EP管中，將EP管放入-4℃保存，得到保種菌；

第二步：種子液制備：取2L三角瓶，加入1000mlLB培養(yǎng)基滅菌，接入500μL卡那霉素和1ml保種菌，在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6-0.8，得到種子液；

第三步：補(bǔ)料培養(yǎng)基制備：按照以下重量份：甘油1-3％，酵母浸膏粉9-11g/L，胰蛋白胨9-11g/L，MgSO₄5-7g/L配置2L的培養(yǎng)基，然后加入補(bǔ)料瓶高壓滅菌，得到補(bǔ)料培養(yǎng)基備用；

第四步：發(fā)酵液制備：按照以下重量份：甘油1％，酵母浸膏粉24g/L，胰蛋白胨10-14g/L，K₂HPO₄7.4-11.4g/L，KH₂PO₄0.8-1.5g/L，MgSO₄1-3g/L，微量元素混合液0.5-1.5ml/L，消泡劑0.1-0.3ml/L配置9L的培養(yǎng)基，然后加入發(fā)酵罐中121℃高壓滅菌20min；

第五步：發(fā)酵工藝：待發(fā)酵罐溫度降至37℃，接入1L種子液和5ml卡那霉素，在罐壓0.06MPa、溫度37℃、PH7.0的條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀＝3.0-3.5，然后將罐溫降至16℃，在降溫過程中攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量以維持DO在28％-32％，待溫度降至16℃，加入最終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)，放罐后以8000rpm的速度離心10min收集培養(yǎng)基中的菌體進(jìn)行純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌生產(chǎn)SUMO酶的發(fā)酵工藝，其特征在于，在第四步中，微量元素混合液由以下重量份原料組成:FeCL₃28-32g/L、ZnSO₄4.8-8.8g/L、CuSO₄4.8-8.8g/L、CaCL₂2.8-6.8g/L、VB10-14g/L、MnSO₄7.8-11.8g/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌生產(chǎn)SUMO酶的發(fā)酵工藝，其特征在于，在第五步中，培養(yǎng)時通風(fēng)比由0.5vvm提升至1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速由100rpm提升至500rpm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌生產(chǎn)SUMO酶的發(fā)酵工藝，其特征在于，在第五步中，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)的時間為16小時，誘導(dǎo)過程中根據(jù)養(yǎng)分消耗情況進(jìn)行補(bǔ)料，保持DO在28％-32％，并根據(jù)菌體生長情況調(diào)節(jié)PH，維持PH6.7-7.0。