[發(fā)明專利]適用于高通量轉(zhuǎn)錄組空間位置信息的檢測方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011291005.6
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112592962B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹罡;戴金霞;吳小鳳;徐偉澤;王忠超;李月;王昊棋;高安然;張凌凱
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué);鯤羽生物科技（江門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6841;C12Q1/6827;G16B25/20
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 劉琳;馮超

本發(fā)明公開了一種適用于高通量轉(zhuǎn)錄組空間位置信息的檢測方法及其應(yīng)用，該方法通過雜交探針的設(shè)計、探針預(yù)處理、樣品雜交、連接反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增，僅需4輪連接測序即可解讀上萬種基因的原位空間轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。依據(jù)其探針設(shè)計特點又可應(yīng)用于點突變以及甲基化位點原位檢測?？蓪崿F(xiàn)單細(xì)胞、單分子、單堿基分辨的高通量基因原位解讀。該方法的信號解讀不依賴超分辨成像平臺，推動了高通量原位空間轉(zhuǎn)錄組的普及和發(fā)展。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量原位雜交領(lǐng)域，具體涉及一種適用于高通量轉(zhuǎn)錄組空間位置信息的檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞學(xué)說的提出為科學(xué)家們對生命體的結(jié)構(gòu)和功能以及其運轉(zhuǎn)機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體中同一組織來源的細(xì)胞也會存在基因組、表觀基因組以及轉(zhuǎn)錄組上的差異；因此基于單細(xì)胞水平的研究尤為重要，應(yīng)運而生的單細(xì)胞測序技術(shù)實現(xiàn)了在單個細(xì)胞水平上面對轉(zhuǎn)錄組或基因組進(jìn)行擴(kuò)增并測序。繼人類基因組計劃的浪潮之后人類細(xì)胞生物分子圖譜計劃(Human BioMolecular Atlas Program HuBMAP)和細(xì)胞圖譜項目蓄勢待發(fā)。

單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)讓我們對細(xì)胞群的異質(zhì)性、發(fā)育過程的動力學(xué)、疾病的發(fā)生發(fā)展以及細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制都有了更深程度的理解。單個細(xì)胞是如何協(xié)調(diào)周圍的多個細(xì)胞發(fā)揮功能僅僅依靠單個細(xì)胞的身份信息是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要借助新的方法來展示每個細(xì)胞的空間位置關(guān)系。運用生物信息學(xué)的方法對RNAseq數(shù)據(jù)中單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聚類分析。由于細(xì)胞標(biāo)記基因的相關(guān)位置信息有很大空白，因而此方法存在很大局限。另一方面，模式生物表達(dá)圖譜以及艾倫腦科學(xué)研究所的小鼠和人類大腦圖譜的廣泛應(yīng)用印證了空間轉(zhuǎn)錄組的前景價值。然而通過傳統(tǒng)原位雜交或細(xì)胞特異性標(biāo)簽基因繪制的傳統(tǒng)的圖譜通量較低，無法解析復(fù)雜的環(huán)路及功能；近年有眾多科學(xué)家通過原位雜交的方法對細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行成像，真實還原了細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)狀態(tài)。

目前主流的原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法有基于單分子原位雜交的多重抗誤差矯正熒光原位雜交技術(shù)(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization,MERFISH)、序貫熒光原位雜交(sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH)、STARmap(Spatially-resolved Transcript Amplicon Readout Mapping。通過對多種不同的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行迭代成像，從而將轉(zhuǎn)錄組的空間位置一一還原。由于每個轉(zhuǎn)錄本上只標(biāo)記了32個熒光分子，該類方法的成像需要借助于超分辨熒光顯微鏡鏡，成本高、技術(shù)要求高，因此很大程度上的限制了其廣泛使用；此外這類方法目前都無法對基因的突變進(jìn)行檢測。

STARmap是一種基于原位測序的方法來展示空間轉(zhuǎn)錄組，運用鎖式探針對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行原位雜交，在鎖式探針上針對不同轉(zhuǎn)錄本設(shè)計了相應(yīng)的barcode，然后通過滾環(huán)擴(kuò)增的方式對雜交的信號進(jìn)行放大，最后通過連接測序的方式對barcode的序列逐輪進(jìn)行解讀，從而高通量的還原具有單細(xì)胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組的空間位置信息。該方法的優(yōu)勢是信號強(qiáng)，可運用普通共聚焦進(jìn)行成像，缺點是效率較低，易出現(xiàn)非特異性，也無法對基因的突變進(jìn)行檢測，只能檢測轉(zhuǎn)錄本的有無。

原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)在高精細(xì)神經(jīng)環(huán)路解析、個體發(fā)育以及疾病發(fā)展等各項研究中有所應(yīng)用，但目前的方法仍然存在下列問題：

1.基于單分子雜交的方法：

1)探針制備繁瑣，成本高：針對每個基因需要設(shè)計24個以上的探針，雖以引物池的形式合成，但后續(xù)每個探針要經(jīng)過PCR低循環(huán)擴(kuò)增、純化、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄、去RNA、再純化等諸多過程。對于高通量多基因雜交工作量大。解讀探針均需要氨基修飾，成本高。

2)組織樣本處理要求高：組織透明處理需將蓋玻片以及載玻片做硅烷化修飾和多聚賴氨酸等多種功能化處理，再進(jìn)行組織水凝膠包埋，氨基修飾固定mRNA等多個步驟。技術(shù)要求高。