[發明專利]一種水稻細菌性條斑病的感病基因OsHXK5及其應用

有效

• 申請號: 202011290233.1
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112375765B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發明（設計）人: 黃勝;金霞;廖舟翔;羅軍;倪哲
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/113;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

本發明公開了一種水稻細菌性條斑病的感病基因OsHXK5及其應用，所述水稻細菌性條斑病菌的感病基因OsHXK5基因特征在于基因序列如SEQ ID No.1所示。本發明利用CRISPR/Cas9技術在水稻中定點突變OsHXK5基因啟動子區的靶標序列，選育抗細條病菌水稻，所述靶標序列如SEQ ID No.2所示。致病實驗表明用本發明方法選育的抗病的水稻NH，對水稻細菌性條斑病菌的抗性明顯增強。在實際應用中OsHXK5基因可作為基因編輯靶標用于培育抗細菌性條斑病水稻新種質，本發明提供的抗病育種方法可用于研發和構建抗病水稻，可廣泛應用于農業生產中的抗病育種。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種水稻細菌性條斑病的感病基因OsHXK5及其應用。

背景技術

由水稻黃單胞菌屬條斑病致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，以下簡稱Xoc)引起的水稻細菌性條斑病，是危害水稻生產的重要細菌性病害之一。該病害在我國秦嶺、淮河以南稻區廣泛流行，通常導致水稻減產5％～20％，較為嚴重時可達到40％～60％，且近年來，該病大量出現在我國的東南部沿海地區并有逐漸蔓延的趨勢，是我國檢疫性病害。目前我國的農業生產主要還是依賴農藥來防治該病，但使用農藥進行防治只能暫時減輕細菌性條斑病的危害，且成本高、污染重、安全性低。病菌長期面對藥劑壓力必定會發生變異，使農藥效果降低。培育和種植抗性品種是防治水稻細菌性條斑病最經濟有效的手段。

植物中的感病基因是病害發生的關鍵基因，其在與病原細菌的效應蛋白直接接觸后會過量表達，隨后激活植物的整個感病通路，最終導致植物發生病害。轉錄因子類似效應蛋白(Transcription activator like effector，簡稱TALE)是Xoc中一類重要的毒性因子，其通過III型分泌系統進入水稻細胞后結合到特定感病基因(Susceptible gene,簡稱S基因)啟動子區的EBE(Effector binding element)序列而激活S基因的表達。在先前的研究中，并沒有任何Xoc中Tal10a靶向OsHXK5基因啟動子區的報道。而這一發現，可以讓我們通過日前已經初步成熟的基因定點編輯技術(CRISPR/Cas9)對感病基因的啟動子區進行修飾，從而培育抗性水稻。

CRISPR/Cas9(成簇、規律間隔短回文重復序列及相關蛋白)系統是來自原核生物的獲得性免疫系統。近年來被發展為對基因組進行定點編輯的新技術，在多種領域都有廣泛的研究和應用。CRISPR/Cas9系統通過導向RNA(guide RNA,gRNA)錨定基因組特定序列，Cas9蛋白對該特定序列進行切割產生雙鏈斷裂，細胞啟動DNA損傷修復機制，借助非同源末端連接或同源重組方式引入突變。目前，仍無運用該技術突變水稻OsHXK5感病基因啟動子區來獲得細菌性條斑病抗性水稻的報道。

發明內容

本發明基于轉基因的基因定向敲除技術提供了水稻細菌性條斑病感病基因OsHXK5，以感病基因OsHXK5為靶點，利用CRISPR/Cas9系統定點編輯水稻OsHXK5基因啟動子區培育廣譜抗細菌性條斑病水稻品種。

為達到上述技術目的，本發明具體通過以下技術方案實現：

本發明以水稻細菌性條斑病菌Xoc和水稻互作轉錄組測序結果為基礎，通過生物信息學預測和半定量RT-PCR驗證，在日本晴中篩選了13個候選的Xoc GX01 TAL效應物靶基因。其中，Tal10a可與基因OsHXK5接合，并激活了該基因的轉錄。且申請人前期的實驗結果證實了Tal10a對Xoc GX01的致病力起貢獻。并利用構建的綠色熒光蛋白報告系統，確認了Tal10a在植物體內能與OsHXK5上游序列結合，激活下游基因的轉錄。

通過人工合成tal效應物的方法來誘導基因編輯水稻中的OsHXK5的表達，經證明所述的感病基因OsHXK5的過表達會導致水稻對細菌性條斑病感病。

所述的感病基因OsHXK5的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。