[發明專利]一種核酸測序方法

有效

• 申請號: 202011289898.0
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112322715B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 白凈衛;杜娟娟;徐揚
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N9/12;C12P19/34
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 楊晞

1.一種核酸測序方法，所述的測序方法包括如下步驟：

（1）提供聚合酶，所述的聚合酶通過可斷裂基團與dNTP連接，并且所述的聚合酶可發出光信號；

（2）使所述聚合酶與待測核酸模板-引物復合體的引物3'端接觸，所述聚合酶上的dNTP與待測核酸的序列上的堿基互補配對并在聚合酶酶促反應加入引物3'端；

（3）檢測所述聚合酶發出的光信號；

所述聚合酶為Bst DNA Pol的變體，所述的Bst DNA Pol的變體的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。

2.根據權利要求1所述的一種核酸測序方法，其特征在于，所述的可斷裂基團含有可斷裂結構X，所述的X選自：

其中，j為1-3的整數，

R選自H、C₁-₁₀直鏈或支鏈烷基、C₂-₁₀烯基、C₂-₁₀炔基、C_3-10環烷基、芳基、含有N、O或S的雜環芳基、含有N、O或S的雜環烷基、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-CON(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)CO(C_0-10烷基)、COR₁、CN，C₁-₁₀烷氧基，芳氧基，含有N、O或S雜芳氧基，上述基團中的H可被以下基團取代：鹵素、-CN、-OCH₂F、-OCHF₂、-OCF₃、-OH、C_1-10直鏈或支鏈烷基、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-OC_0-10烷基、C_3-10環烷基、-O雜環烷基、-N雜環烷基、-S雜環烷基、-N雜環芳香基、-O雜環芳香基、-S雜環芳香基，R₁選自H、OC_0-10烷基、C₁-₁₀直鏈或支鏈烷基，

R'選自N或O。

3.根據權利要求2所述的一種核酸測序方法，其特征在于，所述的可斷裂基團具有L1-L2-X-L3-L4結構，其中，L1為與dNTP或修飾的dNTP結合的端基，L2和L3不存在或為不可斷裂連接基團，L4為與聚合酶結合的端基。

4.根據權利要求3所述的一種核酸測序方法，其特征在于，所述的L1或L4獨立的選自馬來酰亞胺基、羧基、巰基、疊氮基、炔基、環辛炔基及其衍生物、四嗪基、二硫吡啶基、乙烯基、烯砜基、琥珀酰亞胺基、醛基、酰肼基、胺氧基和α-鹵代羰基。

5.根據權利要求3所述的一種核酸測序方法，其特征在于，所述的L2或L3獨立的選自-O(CH₂CH₂O)_i-、-(CH₂)_i-、-(CH₂)_iNH(CH₂)_i-、-(CH₂)_iCOO(CH₂)_i-、-(CH₂)_iCONH(CH₂)_i-、-(CH₂)_iO(CH₂)_i-、-(CH₂)_iCO(CH₂)_i-或中的一個或二個以上基團的組合，所述的i選自0-10的整數。

6.根據權利要求1所述的一種核酸測序方法，其特征在于，所述聚合酶連接有一個或多個熒光標記物、磷光標記物或者化學發光標記物。