[發明專利]一種富含亞全能干細胞來源外泌體原液的制備方法

在審

• 申請號: 202011289601.0
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112410284A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 卓鑫杰;楊苗;姚玲玲;羅保君;孟德龍;宋丹
• 申請（專利權）人: 煥生匯生物基因技術（北京）有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 西安中科匯知識產權代理有限公司 61254
• 代理人: 汪重慶

本發明提供了一種富含亞全能干細胞來源外泌體原液的制備方法；包括：取新生胎兒胎盤，取胎盤絨毛膜進行培養；制備A液；對細胞進行破碎；離心得B液；制備C液；制備得外泌體；制備得D液；將B液和D液按照體積比1:1?5進行混合，得E液。將E液進行FGF因子檢測，按照5000pg?10000pg進行濃縮得富含亞全能干細胞外泌體原液。發明方法采用原料為胎盤，由于胎盤絨毛膜來源亞全能干細胞可以向三胚層多系統分化，具有較低的免疫源性，亞全能干細胞外泌體具有亞全能干細胞的特性；眾所周知，胎盤為醫療廢棄物，本發明利用胎盤制備富含亞全能干細胞來源外泌體原液，實現了變廢為寶。

技術領域

本發明屬于生物技術領域；尤其涉及一種富含亞全能干細胞來源外泌體原液的制備方法。

背景技術

亞全能干細胞為分化功能僅此于全能干細胞，可分化為不同胚層的組織細胞，其細胞特性為分布在身體的所有組織和器官，可分化為不同胚層的細胞，可分化為不同類型的多能干細胞并在生長發育和新陳代謝中維持這些多能干細胞的平衡。在單克隆細胞水平上通過體內外實驗證實：亞全能干細胞能夠向三個胚層多系統分化為各種成熟組織細胞，如造血細胞、脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、上皮細胞、內皮細胞，參與機體多種組織的損傷修復。

外泌體，是一種直徑介于40-100nm的囊泡樣結構。在電子顯微鏡下，外泌體由雙層磷脂膜包裹，內含豐富的蛋白質以及microRNA等成分，多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。外泌體的功能取決于其所來源的細胞類型，其可參與到機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等方方面面。

干細胞外泌體中含有的細胞因子分子量小，具有較強的滲透性，其可以通過人體的皮膚角質層進入表皮層和真皮層。然后，通過旁分泌的形式作用于細胞，使成纖維細胞分泌的I型、III型膠原、糖性蛋白量的提高、增加血管內皮細胞管狀形成率從而使皮膚深層細胞得到激活、滋養和修復，從而起到美容抗衰的作用。可根據靶細胞的需求，改善和修復肌膚，有針對性地參與、調控、激活靶細胞的修復和快速分裂增殖，在細胞層面針對性解決粗糙、松弛個性化護膚問題。

發明內容

本發明的目的是提供了一種富含亞全能干細胞來源外泌體原液的制備方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明公開一種富含亞全能干細胞來源外泌體原液的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：取新生胎兒胎盤，在溫度為4-8℃環境下，6小時內運輸至實驗室，取胎盤絨毛膜使用貼壁發進行培養；

步驟2：將細胞培養至P4，收取P2-P4的細胞培養上清，標記為A液；

步驟3：將P4代細胞消化計數，生理鹽水清洗3次，使用細胞破碎儀對細胞進行破碎，按照10萬-100萬每毫升添加注射用水；

步驟4：將步驟3所得溶液3000rpm離心10分鐘，棄沉淀，將上清4000rpm離心10分鐘，棄沉淀，將上清標記為B液；

步驟5：將A液3000rpm離心5分鐘，棄沉淀，3500rp離心5分鐘，棄沉淀，將上清依次使用100μm、0.45μm、0.22μm細胞篩網過濾得C液；

步驟6：使用PBS對超濾管進行預處理，10ml每支，4000g離心10分鐘；

步驟7：將C液添加至超濾管，15ml每支，4000G離心30分鐘，棄上清，繼續添加C液，4000G離心30分，棄上清，直到C液處理完畢，得外泌體。

步驟8：將步驟7所得外泌體使用B液等體積注射用水重懸，得D液。

步驟9：將B液和D液按照體積比1:1-5進行混合，得E液。