[發明專利]一種ELP-Ⅲ型膠原蛋白的純化方法及應用

在審

• 申請號: 202011286904.7
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112500495A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 張杰
• 申請（專利權）人: 點斗基因科技（南京）有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C12N5/077;A61K8/65;A61Q19/08;C12R1/19
• 代理公司: 南京智造力知識產權代理有限公司 32382
• 代理人: 杜丹

本發明公開了一種類彈性蛋白(Elastin?like polypeptides，ELPs)和Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)的融合蛋白的純化和復性的方法。本發明將類彈性蛋白標簽ELP100與Ⅲ型膠原蛋白多肽基因連接到原核表達載體pRELPN上，構建成pRELPN?CLP Ⅲ?ELP100融合蛋白表達載體，該載體在BL21(DE3)大腸桿菌中高表達。由于該蛋白在大腸桿菌中以胞內包涵體的形式存在，所以我們采用包涵體純化和復性的方法來對該融合蛋白進行純化和復性，包括如下步驟：菌種的收集與破碎，洗除雜蛋白、脂質和核酸，蛋白精純化，滴定稀釋法復性，ITC純化和MTT細胞法活性鑒定，本方法純化得率高、方法簡單，適合于大規模生產。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種ELP-Ⅲ型膠原蛋白的純化方法及應用。

背景技術

類彈性蛋白多肽(ELPs)是一種經過人工改造的、具有彈性且隨溫度變化會發生相變的基因工程多肽，因其在結構上以五肽重復序列單元串聯構成而形成聚合物，即(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)，其中，可以Xaa是除了脯氨酸以外的任何一種氨基酸，通常為纈氨酸(Val，V),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G)亮氨酸(Leu,L)異亮氨酸(Ile,I)，賴氨酸(Lys,K),苯丙氨酸(Phe,F),組氨酸(His,H)等幾種氨基酸類型，重復單元n通常為20-120不等。目前主要合成的方法有兩種，一種化學合成法合成多肽，另一種是基因重組合成法。與化學合成法相比，基因重組合成法具有以下優點：1.通過基因編碼精確控制ELPs的氨基酸序列、分子量、空間折疊結構以及相應的生化性質；2.構建所得包含ELPs基因的質粒載體可長久保存于表達菌株，進行可持續生產；3.ELPs能夠在宿主菌折疊機制的輔助作用下正確折疊成具有活性的二級結構或三級結構，通過后期可溶性蛋白的純化，可直接進行應用研究。ELPs有個最大的特性：溫度敏感性。在低溫時，ELPs可溶于水，聚合物鏈保持無序的結構，且相當伸展。當溫度升高到一個臨界溫度，ELPs將不溶于水，含水的多肽鏈結構就會瓦解并開始聚集，最終以富含ELPs的聚集物的形式沉淀析出，這個臨界溫度稱為ELPs的相變溫度(transition temperature，Tt)，這個過程是可逆的，所以經常采用逆相變循環(Inverse transition cycling,ITC)來對含有ELP標簽的融合蛋白進行純化。本發明根據本公司發表專利申請號20181003668.1描述的pRELPN載體促進克隆在ELP融合蛋白后起始密碼ATG后的外源目的基因獨立高表達，該融合蛋白本身極少表達，并且輕微抑制大腸桿菌或真核細胞等宿主自身蛋白的表達，促進外源目的基因的重組蛋白積聚和高表達，從而有助于解決普通表達載體對外源基因或外源基因與ELP組成的融合基因的低表達或不表達導致不能產業化的問題。

III型膠原蛋白是一種成纖維膠原，在血管中的含量很高，起著重要作用。一方面它能增強血管的強度與彈性，另一方面它提供細胞充足的營養。III型膠原蛋白還能直接與血管母細胞結合，從而形成新血管。III型膠原蛋白是維持皮膚飽滿、潤滑、有光澤的重要元素。III型膠原蛋白進入人體后，能迅速被人體吸收，補充皮膚中隨著年齡的增加而逐漸減少的膠原蛋白。從而使得皮膚具有彈性、水分充足并且能夠明顯減少人的魚尾紋與抬頭紋。目前主要有以下幾種途徑生產膠原蛋白：傳統提取法、化學合成法、現代生物技術生產法。傳統提取主要是通過酸法、堿法和酶法從動物皮毛和結締組織中獲得，所獲得的膠原蛋白活性較低，且帶有安全隱患。隨著基因工程和生物技術的發展，從19世紀80年代以來，人們開始利用生物技術方法生產膠原蛋白，并得到推廣，以滿足人們對膠原蛋白的迫切需求，同時也節約成本，為工業生產膠原蛋白帶來更大的經濟效益。但依然存在許多問題，比如：蛋白純化復雜，需要經過離子交換、分子排阻等一系列層析方法純化，成本高昂。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：為了解決上述背景技術中存在的問題，提供一種改進的ELP-Ⅲ型膠原蛋白的純化方法及應用，解決上述背景技術中存在的問題。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種ELP-Ⅲ型膠原蛋白的純化方法，包含下列步驟：