[發(fā)明專利]一種TaqMan探針熒光定量PCR檢測伯氏考克斯體的方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011284700.X
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112226527B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉為勇;張祺;劉芳;鄔開朗;張艷;朱瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

本發(fā)明提供了一種伯氏考克斯體的實(shí)時熒光定量PCR檢測引物對和探針，所述引物對的序列如SEQ?ID?NO.1?SEQ?ID?NO.2所示；所述探針的序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明還提供了伯氏考克斯體的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒與檢測方法，該試劑盒包括所示引物對和探針。本發(fā)明針對特有基因區(qū)域設(shè)計(jì)了一套特異性PCR引物和TaqMan探針，建立了伯氏考克斯體實(shí)時熒光定量PCR鑒別檢測試劑盒，特異性良好，靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種伯氏考克斯體的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒與檢測方法。

背景技術(shù)

伯氏考克斯體(Coxiella?burnetii)是導(dǎo)致免疫抑制個體發(fā)病率和死亡率的主要誘因。伯氏考克斯體是一種無外殼的雙鏈DNA病原體，伯氏考克斯體對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可感染，人伯氏考克斯體約1/3的已知血清型通常與人類疾病相關(guān)，但一種血清型可引起不同的臨床疾患；相反，不同血清型也可引起同一種疾患。伯氏考克斯體(Coxiella?burnetii)為專性吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性小桿菌。該菌對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，對人和動物有極強(qiáng)的感染力，可通過氣溶膠擴(kuò)散經(jīng)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)導(dǎo)致人及動物發(fā)生感染并導(dǎo)致Q熱。Q熱是一種呈世界性分布的人獸共患病，在我國分布廣泛。人類Q熱分為急性和慢性兩種類型，急性Q熱以發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛為主要癥狀，并常伴有肺炎發(fā)生，部分患者還可發(fā)生肝炎、心肌炎甚至腦膜炎。如果急性Q熱未得到及時或徹底治療可轉(zhuǎn)變?yōu)槁裕鹇愿窝?、心?nèi)膜炎、骨髓炎等。此病原體分離與鑒定的方法主要為：病原體的分離培養(yǎng)，標(biāo)本應(yīng)盡早從感染部位采集。采集患者咽喉分泌物、腦脊液、肺灌洗液等，加抗生素處理過夜，離心取上清接種敏感細(xì)胞(293、Hep-2或HeLa細(xì)胞等)，37℃孵育后可觀察到典型CPE，即細(xì)胞變圓、團(tuán)聚、有拉絲現(xiàn)象，最突出的表現(xiàn)是許多病變細(xì)胞聚在一起呈葡萄串狀。病原體抗原抗體鑒定，用熒光標(biāo)記的抗六鄰體抗體與分離培養(yǎng)細(xì)胞作用來鑒定伯氏考克斯體，也可用血凝抑制(hemoagglutination?inhibition，HI)試驗(yàn)或中和試驗(yàn)(neutralization?test，NT)檢測屬和組特異性抗原并鑒定病原體的血清型。然而常規(guī)的檢測特異性不強(qiáng)，靈敏度也不高。目前還沒有伯氏考克斯體的檢測試劑盒的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種伯氏考克斯體的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒與檢測方法，試劑盒特異性良好，靈敏度高，最低檢測極限達(dá)到1拷貝/uL。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種伯氏考克斯體的實(shí)時熒光定量PCR檢測引物對和探針，所述引物對包括：上游引物的序列如SEQ?ID?NO.1所示；下游引物的序列如SEQ?IDNO.2所示；

所述探針的序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選地，所述探針的5’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為有機(jī)熒光染料或量子點(diǎn)無機(jī)染料中的任一種，所述探針3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)為有機(jī)染料的任一種或者金納米粒子。

更為優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)包括為FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和TexasRed中的一種，所述猝滅基團(tuán)包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一種。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種伯氏考克斯體的實(shí)時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括所述的實(shí)時熒光PCR檢測引物對和探針。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：陽性對照品：陽性標(biāo)準(zhǔn)的DNA；陰性對照品。

本發(fā)明的目的之三在于提供所述的實(shí)時熒光PCR引物對和探針、以及所述的試劑盒在伯氏考克斯體上的用途。