[發明專利]一種TaqMan探針熒光定量PCR檢測巴通體的方法與應用

有效

• 申請號: 202011283235.8
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112410445B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 張祺;梅益;劉為勇;劉芳;劉映樂;祝成亮
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

本發明提供了一種巴通體的實時熒光定量PCR檢測引物對和探針，所述引物對的序列如SEQ ID NO.1?SEQ ID NO.2所示；所述探針的序列如SEQ ID NO.3所示，所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記熒光淬滅基團。本發明還提供了巴通體的實時熒光定量PCR檢測試劑盒與檢測方法，該試劑盒包括所示引物對和探針。本發明針對特有基因區域設計了一套特異性PCR引物和TaqMan探針，建立了巴通體實時熒光定量PCR鑒別檢測試劑盒，特異性良好，靈敏度高。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種巴通體的實時熒光定量PCR檢測試劑盒與檢測方法。

背景技術

巴通體(Bartonella)是一類兼性細胞內寄生的革蘭氏陰性小桿菌或小球桿菌，在系統發育分類中，巴通體屬包括Bergey系統細菌學手冊中立克次體目內的巴通體屬(Bartonella)和羅沙利馬體屬(Rochalimaea)。在1990年以前，人們僅知道桿菌樣巴通體(B.baoilliformis)和由五日熱巴通體(B.quintana)感染能導致人患病，而到目前為止已發現有10余種新的巴通體能導致人患病。人感染巴通體會導致戰壕熱、貓爪病、心肌炎、視神經網膜炎等多種疾病。桿菌樣巴通體具單端鞭毛，羅沙利馬體具菌毛。DALY等和WELCH等用DNA雜交試驗表明，羅沙利馬體與桿菌樣巴通體之間具有高度的親緣關系，兩者可能屬于同一個屬。巴通體可以在人工培養基上生長。但是巴通體生長十分緩慢，初次分離巴通體，在血瓊脂平板上長出菌落需要十多天時間，甚至幾十天時間。此病原體分離與鑒定：普通PCR是快速檢測樣本中病原體的一種實驗室常用技術。依據巴通體的16SrRNA、16S-23S基因間序列、htrA、rpoB基因序列等，建立了多種檢測巴通體的PCR方法。上述所述檢測病原體的方法在一定程度上是有效的，但PCR檢測的假陽性和假陰性等缺點限制了它在臨床上的推廣應用。因此亟需開發一種特異性強、靈敏度高的巴通體檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供了一種巴通體的實時熒光定量PCR檢測試劑盒與檢測方法，試劑盒特異性良好，靈敏度高，最低檢測極限達到1拷貝/mL。

本發明是這樣實現的：

本發明的目的之一在于提供一種巴通體的實時熒光定量PCR檢測引物對和探針，所述引物對包括：上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述探針的序列如SEQ ID NO.3所示，所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記熒光淬滅基團。

優選地，所述探針的5’端標記的熒光基團為有機熒光染料或量子點無機染料中的任一種，所述探針3’端標記猝滅基團為有機染料的任一種或者金納米粒子。

更為優選地，所述熒光基團包括為FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和TexasRed中的一種，所述猝滅基團包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一種。

本發明的目的之二在于提供一種巴通體的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括所述的實時熒光PCR檢測引物對和探針。

優選地，所述試劑盒還包括：陽性對照品：陽性標準的DNA；陰性對照品。

本發明的目的之三在于提供所述的實時熒光PCR引物對和探針、以及所述的試劑盒在巴通體上的用途。

本發明的目的之四在于提供一種巴通體的實時熒光PCR檢測方法，利用所述的巴通體的實時熒光PCR檢測引物對和探針進行實時熒光PCR擴增。

具體地，包括如下步驟：

步驟1、從樣品中提取DNA為模板；

步驟2、配制擴增反應體系進行實時熒光PCR擴增得到擴增曲線，所述擴增反應體系包括所述模板、以及所述的巴通體的實時熒光PCR檢測引物對和探針；