[發明專利]一種TaqMan探針熒光定量PCR檢測軟疣病毒的方法及應用

有效

• 申請號: 202011283234.3
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112280902B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 張祺;劉芳;劉映樂;鄔開朗;張艷;朱瑩
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

本發明公開了一種軟疣病毒實時熒光定量PCR試劑盒，包括實時熒光PCR檢測引物對和探針；所述引物對包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；所述探針的序列為如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記熒光淬滅基團。本發明軟疣病毒實時熒光定量PCR試劑盒，具有良好的特異性，且批內、批間重復性試驗結果的變異系數均小于2％，具有良好的重復性；而且靈敏度大大提高，最小檢出濃度為3拷貝/mL；檢測快速，整個反應過程從待檢品提取DNA到結果分析只要1.5h，且避免了后續電泳等步驟。

技術領域

本發明涉及微生物分子檢測領域，尤其涉及一種軟疣病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒。

背景技術

傳染性軟疣病毒(Molluscum contagiosum virus，MCV)是痘病毒科中以人為惟一宿主的另一類病毒。該病毒通過接觸傳染，感染人后在皮膚上產生良性的腫瘤樣病變。主要感染兒童和青年人，也可以通過性接觸在成人中傳播。在免疫缺陷的病人中通常導致嚴重感染，常規治療難以治愈。痘病毒科病毒感染后傳染性強，危害性各異，但臨床表現均出現皮膚損害，不易區分且容易引起恐慌。傳統檢測病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它們也有不足的地方，如病毒的分離培養，是需要耗費大量人力、物力和時間的，抗體檢測對一些臨床樣本缺乏足夠的靈敏度，有時不能判定出一些正常個體中的潛伏感染。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術之缺陷，提供了一種軟疣病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，更夠快速、準確且靈敏地同時檢測出軟疣病毒，特異性強、靈敏度高。

本發明是這樣實現的：

本發明目的之一在于提供一種軟疣病毒實時熒光定量PCR試劑盒，所述試劑盒包括實時熒光PCR檢測引物對和探針；

所述引物對包括：上游引物如SEQ ID NO.1所示的序列；下游引物如SEQ ID NO.2所示的序列；

所述探針的序列為如SEQ ID NO.3所示的序列，所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記熒光淬滅基團。

優選地，所述探針的5’端標記的熒光基團為有機熒光染料或量子點無機染料中的任一種，所述探針3’端標記猝滅基團為有機染料的任一種或者金納米粒子。所述有機熒光染料為FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red，所述有機猝滅染料為TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

優選地，所述試劑盒還包括：Enzyme Mix、5×PCR Buffer，標準品，對照品。所述陽性標準品為軟疣病毒標準品；所述陰性對照品：RNase Free H₂O。

本發明目的之二在于提供一種軟疣病毒的實時熒光PCR檢測方法，利用所述的軟疣病毒實時熒光PCR檢測試劑盒進行實時熒光PCR擴增。

優選地，所述方法具體包括如下步驟：

步驟1、從樣品中提取DNA為模板；

步驟2、以所述DNA為模板，利用所述的實時熒光PCR檢測試劑盒進行實時熒光PCR擴增得到擴增曲線；

步驟3、對所述擴增曲線進行分析，并做出判斷。

優選地，所述步驟2中擴增的反應體系具體包括：權利要求1所述的軟疣病毒的實時熒光PCR檢測引物對和探針、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；擴增程序為：95度2min；95度15sec、60度1min，40個循環。

優選地，所述步驟3中具體判斷規則為：

當Ct≤35時，判斷樣品為軟疣病毒陽性；