[發(fā)明專利]植物膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子原核表達純化的方法

在審

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• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112322646A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李曉娟;張原;魯雨晴;邊佳輝;姚曉敏;張耿;蘇曉;劉佩佩
• 申請（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/62;C12N15/29;C12P21/02;C07K14/415;C07K1/22
• 代理公司: 北京化育知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11833
• 代理人: 涂琪順

1.植物膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子原核表達純化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：設(shè)計引物構(gòu)建原核表達載體

1)設(shè)計包含相應(yīng)酶切位點的無縫克隆引物，隨后擴增目的基因，在微量PCR離心管中配制10μL PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為：pfu DNAPolymerase 1μL，Buffer(10×)1μL，Mg²⁺1μL，dNTP1μL，Primer-forward和Primer-reverse兩種擴增引物各0.5μL，cDNA 1μL，余量用雙蒸水補齊至10μL；

2)PCR反應(yīng)程序：將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性1min，94℃變性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s 36個循環(huán)，72℃延伸10min，得到PCR產(chǎn)物；

3)利用NEB公司酶切試劑盒中的限制性內(nèi)切酶對PET 30a原核表達載體進行雙酶切：20μL的酶切反應(yīng)液成分為：濃度為50ng/μL質(zhì)粒DNA 5～10μL，NEB Buffer(10×)2μL，BSA(100×)0.2μL，酶₁0.5μL，酶₂0.5μL，余量為雙蒸水補齊；

4)利用無縫克隆技術(shù)將擴增的目的基因連接進入PET 30a原核表達載體中，配置10μL的反應(yīng)液，反應(yīng)體系為：目的基因擴增片段XμL，線性化載體YμL，SmeaLess CLoning Mix(2×)5μL，其余為雙蒸水補齊，其中線性化載體與目的基因擴增片段的摩爾比應(yīng)介于1:1-1:3之間；

5)PCR連接反應(yīng)程序：將配制好的PCR反應(yīng)液，放于PCR儀內(nèi)，反應(yīng)程序為：50℃保溫45min，16℃持續(xù)30min等待回收；

6)將PET 30a原核表達載體與目的基因的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株；

7)在終濃度為50ng/mL的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布活化后的菌液，篩選成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的陽性菌株；

8)選取單菌落，在卡那霉素終濃度為50ng/mL的LB液體培養(yǎng)基中充分活化擴增菌體；

9)利用目的基因的檢測引物檢測活化菌液是否為陽性菌株，配置10μL的反應(yīng)液，反應(yīng)體系為：Taq酶(2×)5μL，Primer-forward-check和Primer-reverse-check兩種目的基因檢測引物各0.5μL，不同活化菌株的菌液為模板1μL，余量為雙蒸水補齊；

步驟2：原核系統(tǒng)中蛋白的表達

1)在500mL卡那霉素終濃度為50ng/mL的LB液體培養(yǎng)基中加入OD₆₀₀在0.8的BL21(DE3)大腸桿菌1-2mL；

2)在37℃180rpm的搖床中，擴增菌體6-8小時，菌體擴增前搖床紫外滅菌20min；

3)檢測菌液OD₆₀₀在0.8時，向菌液中加入終濃度為0.3-0.4mM的IPTG。

4)18℃160rpm的搖床中誘導(dǎo)12-14h；

5)離心機4℃8000rpm離心收集菌體；

步驟3：蛋白純化

1)離心機4℃8000rpm離心收集菌體，重懸于pH：7.4的His標簽融合蛋白裂解buffer，所述pH：7.4的His標簽融合蛋白裂解buffer溶液的配置方法為：pH：7.4的Tris-HcL(終濃度：20mM)，NaCL(終濃度：500mM)，ImidazoLe(終濃度：25mM)，PMSF(終濃度：1mM)，其余為水，其中PMSF需要在使用前加入到溶液中，配置完成的溶液需通過0.45μm的濾菌膜過濾除菌并置于4℃預(yù)冷；

2)將細菌懸浮液置于冰上，超聲破碎細菌獲得破碎的細菌懸浮液，超聲波粉碎儀的參數(shù)設(shè)置為：在28℃60％的超聲強度下，超聲粉碎菌體10min，該過程分別由5s的超聲時間和5s的間隔時間循環(huán)交替組成；

3)離心機4℃12000rpm離心破碎的細菌懸浮液90min，取上清蛋白溶液于新的離心管中，全程應(yīng)維持蛋白溶液處在4℃的低溫環(huán)境下；

4)用10倍體積的ddH₂O清洗gLutathione-sepHarose 4B填料，隨后用10倍體積的pH：7.4的His標簽融合蛋白重懸buffer清洗填料，所述pH：7.4的His標簽融合蛋白重懸buffer溶液的配置方法為：pH：7.4的Tris-HcL(終濃度：20mM)，NaCL(終濃度：500mM)，ImidazoLe(終濃度：25mM)，其余為雙蒸水，配置完成的溶液需通過0.45μm的濾菌膜過濾除菌并置于4℃預(yù)冷；

5)將蛋白溶液與gLutathione-sepHarose 4B填料混勻，放在靜音混合器上4℃混合2h；

6)將結(jié)合后的混合液預(yù)裝柱，待上述蛋白液全部流出后，用4℃預(yù)冷pH：7.4的His標簽融合蛋白重懸buffer清洗柱填料；

7)清洗過程中多次檢測雜蛋白的含量，清洗至完全洗去雜蛋白即可；

8)雜蛋白去除干凈后封閉柱子，加入4℃預(yù)冷的pH：7.4的His標簽融合蛋白洗脫buffer與填料多次混勻，靜置10min，所述pH：7.4的His標簽融合蛋白洗脫buffer溶液的配置方法為：pH：7.4的Tris-HcL(終濃度：20mM)，NaCL(終濃度：500mM)，ImidazoLe(終濃度：250mM)，其余為雙蒸水，配置完成的溶液需通過0.45μm的濾菌膜過濾除菌并置于4℃預(yù)冷；

9)收集洗脫液，即可用于后續(xù)實驗和結(jié)果分析。