[發明專利]COVID-19冠狀病毒的假病毒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011279448.3
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112375768A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 仝嬌;吳成豪;朱宸希;來函宇;馮春朝;周大鵬
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C12N15/867;C12N15/65;C12N15/52;C12N7/00;C12N5/10;C12Q1/18;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

1.一種DNA片段b，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.含權利要求1所述DNA片段b的重組載體，其特征在于，將權利要求1所述DNA片段b經優化后插入真核細胞表達載體中得到。

3.一種COVID-19冠狀病毒的假病毒，其特征在于，是由COVID-19病毒的膜蛋白SARS-CoV-2 S glycoprotein參與到帶有報告基因的缺損型病毒基因組的包裝中得到的COVID-19冠狀病毒的假病毒顆粒；其中：

所述報告基因選自綠色熒光蛋白或螢光素酶；

所述缺損型病毒基因組或其一部分來源于包括VSV、HIV、SARS的病毒，且所述缺損型病毒基因組中所包含的一個或多個結構基因可以去除或者受到調控而失活；

所述COVID-19冠狀病毒的假病毒顆粒可以在帶有或不帶有報告基因序列的情況下包括一段或一段以上編碼生物活性物質的外源序列。

4.權利要求3所述COVID-19冠狀病毒的假病毒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)質粒一的制備：將COVID-19病毒的膜蛋白SARS-CoV-2 S glycoprotein如SEQ IDNO:1所示的DNA片段a插入含Flag標簽的真核細胞表達載體中得到；

(2)質粒二的制備：將COVID-19病毒的膜蛋白SARS-CoV-2 S glycoprotein如權利要求1中SEQ ID NO:2所示的DNA片段b經優化后插入真核細胞表達載體中得到；

(3)質粒三的制備：將一病毒基因組中的囊膜蛋白基因去除并缺陷結構基因Pol和Gag，使該病毒基因組帶有所述報告基因；

(4)用聚醚酰亞胺將上述質粒一、質粒二分別與質粒三、慢病毒包裝質粒通過三質粒慢病毒包裝系統轉染到包裝細胞系HEK293T中，48-72小時后收集細胞上清，提取并純化得到COVID-19冠狀病毒的假病毒顆粒。

5.根據權利要求4所述COVID-19冠狀病毒的假病毒的制備方法，其特征在于，所述慢病毒包裝質粒為psPAX2質粒，和/或

所述真核細胞表達載體為pCMV3質粒。

6.權利要求4所述COVID-19冠狀病毒的假病毒在COVID-19中和抗體研究或藥物篩選研究中的應用。

7.一種COVID-19冠狀病毒的假病毒細胞模型，其特征在于，將權利要求4所述COVID-19冠狀病毒的假病毒感染293T-hACE2細胞。

8.權利要求7所述COVID-19冠狀病毒的假病毒細胞模型在篩選抑制COVID-19進入細胞抑制劑中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，通過檢查細胞內表達缺損型病毒基因組所攜帶的報告基因的表達量定量判斷上述COVID-19冠狀病毒的假病毒的感染效率。

10.一種COVID-19冠狀病毒的假病毒顆粒定量的方法，其特征在于，以anti-RBD(SinoBiological，40592-MM57)鋪板、anti-S1-biotin(Sino Biological，40591-MM43)結合的夾心ELISA法對權利要求4制備得到的COVID-19冠狀病毒的假病毒顆粒包裝培養液中的S蛋白含量進行定量。