[發明專利]以植物甾醇為原料制備膽固醇及其衍生物的方法

在審

• 申請號: 202011274002.1
• 申請日: 2020-11-14
• 公開（公告）號: CN112375118A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 鄒元;甘紅星;謝來賓
• 申請（專利權）人: 湖南科瑞生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07J9/00
• 分類號: C07J9/00;C12P33/00;C12N1/20;C12R1/32
• 代理公司: 長沙科永臻知識產權代理事務所(普通合伙) 43227
• 代理人: 夏勝偉

1.一種膽固醇及其衍生物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：以植物甾醇為起始原料，對植物甾醇的3位羥基進行醚化保護，經生物發酵、氧化、GM-2氧化、witting反應、氫化、水解得到膽固醇及其衍生物。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述膽固醇及其衍生物的制備方法包括如下步驟：

(1)以植物甾醇為起始原料，對植物甾醇的3位羥基進行醚化保護，得到GM-1；

(2)所述GM-1經生物發酵，得到GM-2；

(3)所述GM-2與2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)發生氧化反應，得到GM-3；

(4)所述GM-3與異戊基三苯基溴化膦通過witting反應合成GM-4；

(5)所述GM-4經氫化、水解，得到膽固醇及其衍生物。

3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述植物甾醇具有如式1所示的結構：

即，所示植物甾醇選自菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇。

4.根據權利要求2-3任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述醚化保護的過程包括：將植物甾醇與二甲氧基甲烷混合，然后加入硅藻土、五氧化二磷，攪拌反應，待反應完全后升溫，趁熱過濾，洗滌，烘干，得到植物甾醇醚化物粗品；采用丙酮對所述植物甾醇醚化物粗品進行純化，得到所述植物甾醇醚化物GM-1。

5.根據權利要求2-4任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述生物發酵的過程包括：(a)種子培養；(b)將步驟(a)培養得到的種子GM-1接種在含有GM-1的培養基中，進行發酵轉化，經后處理，回收提取，得到GM-2。

6.根據權利要求2-5任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(a)中，所述種子培養包括一級種子培養和二級種子培養；

所述一級種子培養包括如下步驟：在冷卻且滅菌的培養基的斜面上接種Mycobacterium sp.NRRL B-3805菌種進行培養，得到一級種子；所述培養基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸鈉0.54％、磷酸氫二氨0.06％，pH＝7.5；

其中，所述二級種子培養包括如下步驟：在冷卻且滅菌的培養基的斜面上接種一級種子進行培養，得到二級種子；所述培養基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸鈉0.54％、磷酸氫二氨0.06％，pH＝7.5。

7.根據權利要求2-6任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(b)中，在發酵罐內裝入含有GM-1的培養基，滅菌，冷卻，接種二級種子，進行發酵轉化，轉化結束后調節pH值至5-6，加熱攪拌，靜置，分層，得到油層；將轉化得到的油層用甲醇提取，減壓濃縮干溶劑，再加入乙酸乙酯回流打漿，冷卻，過濾，濾液回收提取，得到GM-2；

其中，含有GM-1的培養基含有GM-1 2％、大豆油16％、玉米漿6％、硝酸鈉5.4％、磷酸氫二銨0.06％，培養基的pH＝8.0。

8.根據權利要求2-任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述GM-2與2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)的質量比為(90-110):1；

所述氧化反應包括如下步驟：將GM-1和TEMPO在室溫下溶解于二氯甲烷中，降溫至0-5℃，加入溴化鈉溶液，攪拌，保持溫度0-5℃，而后滴加次氯酸鈉溶液，滴加過程控溫0-5℃，滴加完后保持0-5℃反應，TLC監測，原料反應完后，攪拌下滴加硫代硫酸鈉溶液；滴加完后攪拌，靜置分液，得到的有機層減壓濃縮，甲醇置換濃縮至稠狀，降溫析晶，過濾，濾餅少量甲醇淋洗，干燥得GM-3。

9.根據權利要求2-8任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，室溫下將異戊基三苯基溴化膦和甲苯攪拌混合，氮氣置換，加入叔丁醇鉀，升溫后反應；而后降溫，氮氣保護下加入GM-3，保溫反應；反應完成后向反應瓶中加入水，分液，有機相水洗；減壓濃縮，甲醇置換至稠狀，降溫析晶，過濾，干燥濾餅，得到GM-4。

10.根據權利要求2-9任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，在鈀碳存在條件下，將GM-4加入甲醇中，先用氮氣置換，再用氫氣置換，在氫氣氣氛下升溫反應，反應完畢后，降至室溫，排掉氫氣，過濾，少量甲醇沖洗濾餅，合并母液；向母液中加入稀鹽酸，加熱進行水解反應，反應完成后調節pH至中性，減壓濃縮，水析出料，過濾得到膽固醇。