[發(fā)明專利]一種以基因芯片轉(zhuǎn)制印板再大量印制基因芯片的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011270744.7
• 申請(qǐng)日: 2020-11-13
• 公開（公告）號(hào): CN114471394A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華子昂;劉寶全;朱美瑛;王明齊;萬君興;竹添;孫寧;張建;李娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京華牛世紀(jì)生物技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): B01J19/00
• 分類號(hào): B01J19/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種以基因芯片轉(zhuǎn)制印板再大量印制基因芯片的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1 獲得初始基因芯片成品及相關(guān)信息，包括：探針序列及其相關(guān)排列順序、初始基因芯片的點(diǎn)陣密度；

S2 在印板材料上以蝕刻技術(shù)制備微針集群，微針集群與初始基因芯片的點(diǎn)陣密度匹配，保證每一個(gè)微針位置對(duì)應(yīng)一個(gè)探針序列；

S3 對(duì)微針尖端進(jìn)行表面活化，將表面活化基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾保護(hù)，再對(duì)印板材料進(jìn)行表面鈍化處理，消除印板材料影響后繼模板序列合成的影響；

S4 在四塊印板材料的微針上分別去除化學(xué)修飾保護(hù)基團(tuán)，通過共價(jià)連接方式將一種核苷酸固定在微針上，核苷酸通過模板連接臂與印板的共價(jià)連接點(diǎn)連接在一起；且每塊印板材料只連接一種核苷酸，每個(gè)微針尖端的活化基團(tuán)上只連接一個(gè)核苷酸；

S5 根據(jù)初始基因芯片成品上探針序列及其相關(guān)排列順序，以探針序列的3'末端堿基的互補(bǔ)堿基為基準(zhǔn)繪制探針序列的3'末端堿基的互補(bǔ)堿基分布圖；

S6 依據(jù)探針序列的3'末端堿基的互補(bǔ)堿基分布圖，分別從四塊已經(jīng)共價(jià)連接核苷酸的印板材料上截取相應(yīng)區(qū)塊并粘貼于印板固定載體上，最終獲得與初始基因芯片成品上探針對(duì)應(yīng)的微針集群，且每個(gè)微針尖端的堿基都與相應(yīng)位置上的探針序列的3'末端堿基互補(bǔ)；

S7在初始基因芯片成品上鋪滿DNA聚合酶及其對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系（滿足探針合成的相關(guān)要素），利用精準(zhǔn)定位技術(shù)將印板固定載體精確安置在基因芯片成品上并保證微針尖端上共價(jià)連接的核苷酸能夠與初始基因芯片成品上探針序列的3'末端堿基互補(bǔ)配對(duì)；

S8 DNA聚合酶在相關(guān)蛋白的協(xié)助下組裝DNA復(fù)制起始復(fù)合體，DNA復(fù)制起始復(fù)合體中包括：噬菌體Φ29的DNA聚合酶、噬菌體Φ29的末端蛋白、噬菌體Φ29的p6單鏈DNA結(jié)合蛋白、四種DNA合成底物dNTP、相應(yīng)的DNA聚合酶合成DNA所需要的相應(yīng)成份，DNA復(fù)制起始復(fù)合體能夠以初始基因芯片成品上探針序列為指導(dǎo)、以微針尖端的核苷酸起始按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自動(dòng)、忠實(shí)地合成模板序列，該模板序列與探針序列完全互補(bǔ)；

S9 利用升溫變性的方法使新合成的模板序列與初始基因芯片成品上探針序列分開，通過液壓加壓的方法使初始基因芯片與印板固定載體分離，初始基因芯片可繼續(xù)用于下一輪的印板制備，而印板固定載體連同將上面固定的微針集群、微針尖端新合成的模板集群將轉(zhuǎn)移到清洗等后期處理工序，最后封裝保存，用于相應(yīng)的質(zhì)量與性能檢測，合格產(chǎn)品（印板）即為用于基因芯片生產(chǎn)；

S10按一種通過組合方式制造的原位合成基因芯片探針用基片提供的方法，利用標(biāo)準(zhǔn)模式初始基片或定制模式初始基片通過組合方式制造原位合成基因芯片探針用基片；按一種利用DNA聚合酶原位合成基因芯片探針的方法制作基因芯片；具體操作過程如下：

（1）將帶有全部基因芯片探針的5'端第一個(gè)核苷酸的基片轉(zhuǎn)入基因芯片合成儀器中，在基片上DNA聚合酶反應(yīng)體系（包括：噬菌體Φ29的DNA聚合酶、噬菌體Φ29的末端蛋白、噬菌體Φ29的p6單鏈DNA結(jié)合蛋白、四種DNA合成底物dNTP、相應(yīng)的DNA聚合酶合成DNA所需要的相應(yīng)成份）；

（2）將印板浸入到噬菌體Φ29的DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中（含噬菌體Φ29的p6單鏈DNA結(jié)合蛋白），噬菌體Φ29的p6單鏈DNA結(jié)合蛋白與印板上微針尖端的模板序列結(jié)構(gòu)，避免模板序列形成二級(jí)結(jié)構(gòu)和促進(jìn)模板組裝形成DNA復(fù)制起始復(fù)合體；

（3）利用印板固定載體將印板與基片精確定位組裝在一起，保證每個(gè)微針尖端結(jié)合的模板序列的3'端第一個(gè)堿基與基片上對(duì)應(yīng)位置的起始?jí)A基配對(duì)，并有效組裝DNA復(fù)制起始復(fù)合體，利用噬菌體Φ29的DNA聚合酶自動(dòng)且忠實(shí)地以模板序列為指導(dǎo)按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成基片上的探針序列，新合成的探針序列與印板上的模板序列完全互補(bǔ)；

（4）利用升溫變性的方法將基因芯片上新合成的探針序列與模板序列解除配對(duì)，通過液壓加壓的方法使新合成基因芯片與印板（連同印板固定載體）分離，印板可繼續(xù)用于下一輪的基因芯片制備，而完成探針合成的基片將轉(zhuǎn)移到清洗等后期處理工序，最后封裝保存，用于相應(yīng)的質(zhì)量與性能檢測，合格基因芯片投入市場。