[發(fā)明專(zhuān)利]一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011264982.7
• 申請(qǐng)日: 2020-11-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112322657B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宮麗穎;陳龍飛;應(yīng)躍斌;靳婷;祝靜靜;梁學(xué)軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江新碼生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/02;G01N33/74
• 代理公司: 北京沁優(yōu)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11684
• 代理人: 姜宇

1.一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

1)獲得功能性質(zhì)粒：獲得序列為SEQ?ID?NO.1的cDNA，然后克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA^TM3.1(+)的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ之間，得到質(zhì)粒pCDNA3.1+flmGHR；獲得序列為SEQ?ID?NO.2的cDNA，然后克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA^TM3.1(+)的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ之間，得到質(zhì)粒pCDNA3.1+STAT5a；獲得質(zhì)粒PGL4.52；獲得序列為SEQ?IDNO.3的cDNA，然后克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA^TM3.1(+)的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ之間，得到質(zhì)粒pCDNA3.1+JAK2；

2)獲得檢測(cè)細(xì)胞：將所述質(zhì)粒pCDNA3.1+flmGHR、所述質(zhì)粒pCDNA3.1+STAT5a、質(zhì)粒PGL4.52和質(zhì)粒pCDNA3.1+JAK2以9～12:0.8～1.2:85～90:2～5的比例混合，共轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中得到檢測(cè)細(xì)胞；

3)活性檢測(cè)：將所述檢測(cè)細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后加入被檢測(cè)物和ONE-Glo^TM檢測(cè)試劑，用酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值，根據(jù)所述化學(xué)發(fā)光值得到人生長(zhǎng)激素的體外活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述獲得檢測(cè)細(xì)胞步驟中的所述真核細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述獲得檢測(cè)細(xì)胞步驟中所述質(zhì)粒pCDNA3.1+flmGHR、所述質(zhì)粒pCDNA3.1+STAT5a、質(zhì)粒PGL4.52和質(zhì)粒pCDNA3.1+JAK2的混合比例為10:1:85:4。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述獲得檢測(cè)細(xì)胞步驟中轉(zhuǎn)染的具體操作為：HEK293細(xì)胞用DMEM和10％FBS培養(yǎng)基于37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，然后采用轉(zhuǎn)染試劑HD進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述獲得檢測(cè)細(xì)胞步驟與所述活性檢測(cè)步驟之間設(shè)有穩(wěn)定細(xì)胞株篩選步驟；

所述穩(wěn)定細(xì)胞株篩選步驟，將從所述獲得檢測(cè)細(xì)胞步驟中得到的所述檢測(cè)細(xì)胞使用胰蛋白酶消化分離，然后將分離后的所述檢測(cè)細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中篩選培養(yǎng)得到第一篩選細(xì)胞群，所述細(xì)胞培養(yǎng)皿中的克隆培養(yǎng)基為含0.1mg/mL潮霉素B、0.75mg/mL的G418、10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將所述第一篩選細(xì)胞群采用胰蛋白酶消化，并使用有限稀釋法進(jìn)行分離，得到單克隆的第一篩選細(xì)胞；

所述第一篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)移到盛有所述克隆培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行擴(kuò)增，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中均擴(kuò)增得到單克隆細(xì)胞株，將每個(gè)所述單克隆細(xì)胞株均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并采用饑餓培養(yǎng)基在黑色細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)組中加入rhGH標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照組中加入等量所述饑餓培養(yǎng)基，所述饑餓培養(yǎng)基為含有1％胎牛血清、0.1mg/mL潮霉素B和0.75mg/mL的G418的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，然后加入ONE-Glo^TM檢測(cè)試劑，用酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值分別得到實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值，計(jì)算所述實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值的比值，若所述實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值的比值大于基準(zhǔn)值時(shí)，則所述單克隆細(xì)胞株為陽(yáng)性克隆株；若所述實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值的比值小于或等于基準(zhǔn)值時(shí)，則所述單克隆細(xì)胞株為陰性克隆株；

將所述陰性克隆株丟棄，留存全部所述陽(yáng)性克隆株，將所述陽(yáng)性克隆株進(jìn)行多代傳代培養(yǎng)，檢測(cè)所述陽(yáng)性克隆株在rhGH存在環(huán)境下產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光值，挑取所述化學(xué)發(fā)光值最大的對(duì)應(yīng)陽(yáng)性克隆株作為所述活性檢測(cè)步驟中的所述檢測(cè)細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種人生長(zhǎng)激素的體外活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述活性檢測(cè)步驟中所述培養(yǎng)基為所述饑餓培養(yǎng)基。