[發(fā)明專利]用于檢測肺炎支原體的引物組、試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011261291.1
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112831578B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張珂;李威
• 申請（專利權(quán)）人: 上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 王衛(wèi)彬;黃益澍

本發(fā)明公開了一種檢測肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)的引物組、試劑盒和方法，所述引物組包括MP外引物對、MP內(nèi)引物對、MP環(huán)引物對，所述MP外引物對的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述MP內(nèi)引物對如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述MP環(huán)引物對如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本發(fā)明提供的引物組、試劑盒和方法具有靈敏度高(能達(dá)到100copies/反應(yīng))、檢測準(zhǔn)確、檢測速度快且檢測過程簡單的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、體外診斷與檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測肺炎支原體的引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

肺炎支原體是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，是全球各地冬春季節(jié)的主要流行病原，具有高度的傳染類，嬰幼兒尤其易感，在中國人群的感染率較高，且近年感染發(fā)生率呈上升趨勢。肺炎支原體感染可引起肺炎，甚至侵蝕肺外器官，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。呼吸道病原體種類很多，主要包括病毒類、細(xì)菌類、肺炎支原體、肺炎衣原體，此外還有一些屬于原蟲類和真菌類等等。不同病原菌的首選治療藥物和治療方案并不相同，單就抗生素而言，因病原體差異首選有效抗生素完全不同，但不同病原體造成的病征有很大的相似度，難以區(qū)分，精準(zhǔn)快速的區(qū)分病原體種類成為有效治療疾病、控制疫情蔓延的關(guān)鍵，以爭取盡早使用正確的藥物，同時(shí)避免無效抗生素濫用。

目前，國內(nèi)肺炎支原體臨床診斷，以“間接熒光法呼吸道九聯(lián)檢抗體檢測”和“金標(biāo)層析法的2-5聯(lián)檢抗原檢測”為代表的免疫法產(chǎn)品為主，此外還有其他一些技術(shù)產(chǎn)品。從技術(shù)原理的角度，可以分為培養(yǎng)法、抗原免疫檢測法、血清特異性抗體免疫檢測法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(實(shí)時(shí)熒光PCR、熒光定量PCR、Real-time quantitative PCR、Real-time qPCR、qPCR、QPCR等)為代表的分子診斷法。但這些方法都有明顯的技術(shù)缺陷、應(yīng)用制約因素，比如，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)面臨著核酸提取和檢測操作復(fù)雜、儀器平臺和操作人員要求高等一系列問題，成本高且使用場景有限。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明提出一種基于LAMP恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)使用的引物組、試劑盒和方法，本發(fā)明創(chuàng)新性地開發(fā)無需純化的一步法樣本核酸抽提技術(shù)，免去繁瑣的手工操作步驟；設(shè)計(jì)優(yōu)選靶標(biāo)特異性的引物組、開發(fā)優(yōu)化反應(yīng)配方，提高檢測效率；開發(fā)優(yōu)化凍干配方，制成可冷藏保存/常溫運(yùn)輸?shù)脑噭┖校瑯O大地拓寬了本發(fā)明產(chǎn)品應(yīng)用場景。

本發(fā)明使用的核心技術(shù)方法為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是近年來發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，屬于分子診斷方法的一種。LAMP技術(shù)具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、樣本耐受度高、操作便捷、硬件成本低等優(yōu)點(diǎn)。該方法為日本榮研公司的專利技術(shù)，所涉專利包括CN100393875C、CN1222614C、CN100422323C等。

LAMP方法針對靶序列的8個區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3、上下游內(nèi)引物FIP和BIP、上下游環(huán)引物L(fēng)F和LB)，利用一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件保溫60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀，也可通過嵌入式染料進(jìn)行更為精準(zhǔn)的熒光定量。本發(fā)明人創(chuàng)造性地使用該技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物組，并對反應(yīng)體系中的各項(xiàng)條件進(jìn)行了摸索。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明第一方面涉及一種用于檢測肺炎支原體的引物組，該引物組具有特異性強(qiáng)(對其他病原體沒有檢測活性)、靈敏度高、通用性好(種內(nèi)各亞型通用)的特點(diǎn)。該引物組的具體序列如表1中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。

表1 引物序列表

所述引物的設(shè)計(jì)過程如下所示：