[發明專利]一種制備感光細胞的方法

有效

• 申請號: 202011259603.5
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112481199B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 曾皓宇;劉園月;劉素娜;林海珠;張曉敏;劉又瑜;黃嘉莉
• 申請（專利權）人: 廣東普羅凱融生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0793;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚

1.一種制備感光細胞的方法，所述方法包括以下步驟：

（1）將人源多能干細胞誘導分化為成纖維細胞；

（2）在步驟（1）所得的成纖維細胞中轉染Nrl-tRFP基因，得到Nrl-tRFP成纖維細胞；

（3）將步驟（2）所得的Nrl-tRFP成纖維細胞誘導分化為感光細胞；

其中步驟（3）具體包括以下操作：

第一階段：在Nrl-tRFP成纖維細胞中加入第一培養基，每100ml所述第一培養基包括：

KOSR:?10mL；

B27:2mL；

Noggin:?25μL；

IGF1:2.5?μL；

DMEM/F12:?88mL；

丙戊酸：0.5?mM；

CHIR99021：?4.8?μM；

RepSox：2?μM；

Forskolin：?10?μM；

第二階段：將第一培養基更換為第二培養基，每100ml所述第二培養基包括：

KOSR:?10mL；

B27:2mL；

Noggin:?25μL；

IGF1:2.5?μL；

DMEM/F12:?88mL；

丙戊酸：0.5?mM；

CHIR99021：?4.8?μM；

RepSox：2?μM；

Forskolin：?10?μM；

IWR1：10?μM；

第三階段：將第二培養基更換為第三培養基，每100ml所述第三培養基包括：

KOSR:?10mL；

B27:2mL；

Noggin:?25μL；

IGF1:2.5?μL；

DMEM/F12:?88mL；

丙戊酸：0.5?mM；

CHIR99021：?4.8?μM；

RepSox：2?μM；

Forskolin：?10?μM；

IWR1：10?μM；

SonicHedgehog：?3?nM；

牛磺酸：100?μM；

視黃酸：1?μM；

第四階段：將第三培養基更換為第四培養基，每100ml所述第四培養基包括：

B27:?2mL；

N2:?1mL；

Noggin:?50?μL；

IWR1:?100?μL；

IGF1:?5μL；

bFGF:?80?μL；

DMEM?/F12:?97mL；

丙戊酸：0.5?mM；

CHIR99021：4.8?μM；

RepSox：2?μM；

Forskolin：10?μM。

2.如權利要求1所述的制備感光細胞的方法，其中，第一階段為2～3天；第二階段為4～5天；第三階段為3～4天；第四階段為4～5天。

3.如權利要求1所述的制備感光細胞的方法，其中步驟（1）具體包括以下操作：

（1）用基質膠包被培養瓶，用mTeSR1培養基或E8培養基培養人源多能干細胞；

（2）待人源多能干細胞貼壁生長至80%，清洗后，加入MEF培養基；

（3）培養6~12天，期間要換液；

（4）消化細胞，離心，按照細胞密度1×10⁶/孔，將細胞鋪在用基質膠包被6孔板中；

（5）培養5天，消化細胞，離心，按照細胞密度2×10⁵/孔，將細胞鋪在用0.1%明膠包被的6孔板中；

（6）細胞培養3~5天，即可得到成纖維細胞。