[發明專利]一種具有毛囊再生功能的人體外分泌腺干細胞提取方法

在審

• 申請號: 202011259366.2
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112410288A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 熊志軍;王慧;劉文;王晨
• 申請（專利權）人: 安徽惠恩生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 王依

本公開公開一種具有毛囊再生功能的人體外分泌腺干細胞提取方法,其特征在于，包括以下步驟：取人類外分泌腺組織，沖洗，剪碎；剪碎的組織用一型膠原酶將外分泌腺組織消化；收集消化細胞，得到單細胞懸液；培養細胞；得到細胞懸液，按細胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液中；離心機離心；吸取富含有核細胞的中間細胞層；將獲取的單個核細胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培養基中，連續培養；用濃度為10μg/ml的纖連蛋白溶液篩選干細胞，該方法提取的細胞量大、存活率高、更易于在培養瓶內貼壁、細胞活性好。

技術領域

本公開屬于生物細胞領域，具體涉及一種具有毛囊再生功能的人體外分泌腺干細胞提取方法。

背景技術

分泌腺有內分泌腺和外分泌腺兩大類,兩者之間的區別主要在于內分泌腺無排泄管，腺細胞排列缺乏極性，多聚集成團塊狀或索狀。內分泌腺分泌的分泌物稱激素。其分泌物直接進入細胞周圍的血管和淋巴，由血液和淋巴輸送到各組織或器官中。而外分泌腺有排泄管，稱腺導管，其分泌物通過腺導管輸送到相應的組織或器官發揮其調節作用；

目前以人體外分泌腺干細胞提取方法主要為機械酶解法和傳統灌洗法兩種。機械酶解法雖然能獲取數量較多的細胞，但其中的人體外分泌腺干細胞含量較低，同時很難避免胎盤中母源性細胞的干擾。傳統灌洗法整個提取過程操作繁復、耗時長、成本高，提取出來的細胞活率相對較低。

發明內容

針對現有技術的不足，本公開的目的在于提供一種具有毛囊再生功能的人體外分泌腺干細胞提取方法，解決了現有技術中人體外分泌腺干細胞在提取過程中細胞活性不穩定，細胞存活率低、細胞數低的問題。

本公開的目的可以通過以下技術方案實現：

一種具有毛囊再生功能的人體外分泌腺干細胞提取方法,包括以下步驟：

1)取人類外分泌腺組織，沖洗，剪碎；

2)剪碎的組織用一型膠原酶將外分泌腺組織消化；

3)收集消化細胞，得到單細胞懸液；

4)培養細胞，傳代5次；

5)將培養細胞加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，得到細胞懸液，按細胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細胞懸液加入到所述的干細胞分離液中；

6)常溫離心機中以1500r/min進行密度梯度離心15分鐘；

7)小心吸取富含有核細胞的中間細胞層；

8)將獲取的單個核細胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培養基中，接種于培養瓶內中，在37℃、5％CO2孵育箱連續培養；

9)用濃度為10μg/ml的纖連蛋白溶液篩選干細胞。

進一步地，所述分離液按重量份數包括以下組分：

泛影葡胺：3-8份，

羥甲基纖維素：3-10份，

氯化銫：0.01-1.0份，

聚蔗糖：0.01-10份；

聚乙二醇:0.01-8份

將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細胞分離液的濃縮液；將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.090-1.120g/ml。

進一步地，所述人類外分泌腺組織，采用無菌PBS反復沖洗人類外分泌腺組織直至其無血液。