[發明專利]基于等溫指數擴增的microRNA生物傳感器

在審

• 申請號: 202011256208.1
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112342277A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 左國偉;劉丹;張章
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于等溫指數擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法包括以下步驟：

(1)、發卡探針的制備將分別裝有HPLC純化的HP1、HP2和熒光探針核酸鏈凍干粉的EP管以12000rpm離心5分鐘，在此EP管中分別加入180μL、180μL和300μL DEPC水配制成10umol/L的溶液。然后將此EP管置于95攝氏度水浴箱中孵育5分鐘，之后關閉水浴箱緩慢下降至室溫，從而制備發卡結構探針，將裝有所述發卡探針的EP管用錫箔紙包裹后置于-20攝氏度保存。

(2)、指數等溫擴增取上述制備的HP1、HP2和熒光發卡探針溶液各0.1μL、0.2μL和2μL與緩沖液混合后得到50μL反應溶液，在反應液中加入待檢microRNA，并于37攝氏度下反應90分鐘，然后80攝氏度下孵育20分鐘。

(3)、信號檢測將上述反應后的液體加入到100μL石英比色皿，將比色皿置于熒光分光光度計中，將激發和發射的狹縫寬度設置為5nm，PMT檢測器高電壓設置為600v，以495nm的光激發樣品，并以1nm的步長從510nm至650nm掃描熒光發射檢測熒光信號。這樣就建立起基于等溫指數擴增的microRNA生物傳感器。

2.如權利要求1所述的基于等溫指數擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟1中所用的核酸探針均采用HPLC方式純化。

3.如權利要求1所述的基于指數等溫擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟1中加入裝有HP1、HP2和發卡探針EP管中的DEPC水分別為180μL、180μL和300μL，制備成10uM的溶液。

4.如權利要求1所述的基于指數等溫擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟1中發卡探針制備是在95攝氏度孵育5分鐘之后緩慢降至室溫。

5.如權利要求1所述的基于指數等溫擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟2中各取HP1、HP2和發卡探針0.1μL、0.2μL和2μL到50μL反應液中，反應液中HP1、HP2和發卡探針的濃度分別為20nmol/L，40nmol/L和400nmol/L。

6.如權利要求1所述的基于指數等溫擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟2中反應液成分包括1.25個單位U Klenow fragment DNA聚合酶，5個單位Nb.BbvCI內切酶，500umol/L dNTPs混合液，20nmol/L HP1，40nmol/L HP2，400nmol/L熒光發卡探針、NEBuffer 2(pH 7.9，10mM Tris-鹽酸，10mM氯化鎂，50mM NaCl和1mM DTT)和CutSmart(pH7.9，20mM Tris-乙酸鹽，500mM乙酸鉀，100μg/mL BSA和10mM醋酸鎂) 。

7.如權利要求1所述的基于等溫指數擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟2中反應液37攝氏度下反應時間是90分鐘，然后在80攝氏度下反應時間是20分鐘。

8.如權利要求1所述的基于指數等溫擴增的microRNA生物傳感器，其制備方法步驟3中將檢測條件設置為激發和發射的狹縫寬度均為5nm，PMT檢測器高電壓為600v，激發波長為495nm，并以1nm的步長從510nm 至650nm掃描熒光發射。