[發(fā)明專利]一種外周血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011252392.2
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112410294A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉宇;林冠妃;郭康合;李崴;蔡開婷;吳清毅;陳多峰
• 申請（專利權(quán)）人: 海南優(yōu)尼科爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/078
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 葉培輝

本發(fā)明公開了一種外周血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：外周血通過離心提取制備獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，并取單個(gè)核細(xì)胞，加入到含有IFN?γ、IL?2、抗CD3單克隆抗體的完全初始培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，完全初始培養(yǎng)基為GT?T551H3細(xì)胞培養(yǎng)液；在細(xì)胞培養(yǎng)3天后，加入完全補(bǔ)液培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，其中，每隔2～3天添加補(bǔ)液培養(yǎng)基一次，整個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為15～21天，得到所述CIK細(xì)胞。本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是提供了一種增殖效果較好，有效提高該細(xì)胞的增殖活性和殺傷活性的外周血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種外周血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

近年來，隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)對腫瘤治療決策的深入研究，免疫效應(yīng)細(xì)胞已成為治療腫瘤疾病的第四大技術(shù)，受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，其已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)及突破口。CIK細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞胞毒活性最強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，也是最具發(fā)展前景的免疫細(xì)胞，在臨床應(yīng)用上被廣泛發(fā)展。

CIK細(xì)胞即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，同時(shí)具有NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物的限制性殺傷腫瘤效應(yīng)及T細(xì)胞的高度殺傷腫瘤活性，并且可同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子。CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、增殖速度快及殺瘤譜廣等優(yōu)點(diǎn)，被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為是過繼免疫治療腫瘤的希望。CIK細(xì)胞免疫療法可有效殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，并且具有效果明顯、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。

目前，CIK細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用多是抽取患者外周血提取單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增從而得到所述的CIK細(xì)胞。細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞的方法是目前應(yīng)用的最廣泛也是最便捷的培養(yǎng)方法，但是各個(gè)因子的配伍以及因子的具體含量使用不一所獲得的CIK細(xì)胞的數(shù)目、擴(kuò)增效率及殺傷率也有很大的不同，現(xiàn)有技術(shù)中的外周血CIK培養(yǎng)方法，普遍存在擴(kuò)增倍率低、細(xì)胞活性差等問題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有難題，本發(fā)明提供了一種增殖效果較好，有效提高該細(xì)胞的增殖活性和殺傷活性的外周血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種外周血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)制備外周血單個(gè)核細(xì)胞：外周血在初步離心得到血漿后，血細(xì)胞成份與生理鹽水等量混勻加入到Ficoll細(xì)胞分離液上，經(jīng)過離心，收集白膜層，再清洗離心收集，得到單個(gè)核細(xì)胞；

2)單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)：取步驟1)所得的單個(gè)核細(xì)胞加入到含有IFN-γ、IL-2、抗CD3單克隆抗體的完全初始培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，完全初始培養(yǎng)基為GT-T551H3細(xì)胞培養(yǎng)液；在細(xì)胞培養(yǎng)3天后，向培養(yǎng)體系中加入完全補(bǔ)液培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，每隔2～3天向培養(yǎng)體系中添加補(bǔ)液培養(yǎng)基一次，整個(gè)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為15～21天，得到所述CIK細(xì)胞。

其中，IFN-γ、IL-2、抗CD3單克隆抗體均可從市場上購買得到，也可以自行制備。

進(jìn)一步地，所述單個(gè)核細(xì)胞以(0.5～1.5)×10⁶個(gè)/mL的密度加入到完全初始培養(yǎng)液中培養(yǎng)，具體可以取密度為：0.5×10⁶個(gè)/mL、0.6×10⁶個(gè)/mL、0.7×10⁶個(gè)/mL、0.8×10⁶個(gè)/mL、0.9×10⁶個(gè)/mL、1.0×10⁶個(gè)/mL、1.2×10⁶個(gè)/mL、1.3×10⁶個(gè)/mL、1.5×10⁶個(gè)/mL加入到培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中包括自體血漿。

進(jìn)一步地，所述自體血漿在培養(yǎng)體系中的體積百分比為0％～20％。