[發明專利]一種非酒精性脂肪肝小鼠模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202011251787.0
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112352739A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 吳英杰;孫杰;姜如嬌;冉麗媛;郭美華;于東
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85
• 代理公司: 大連至誠專利代理事務所(特殊普通合伙) 21242
• 代理人: 楊威;裴盈欣

本發明公開了一種非酒精性脂肪肝小鼠模型及其構建方法，具體構建步驟為：步驟一：轉染小鼠胚胎干細胞，將包含ghr基因第4和第5外顯子片段利用Pfu Turbo DNA聚合酶擴增并克隆到pCR Blunt II?TOPO載體中。本發明通過此方法建模的小鼠在8周齡時，肝臟體積顯著增加，HE染色和油紅染色結果均呈脂肪肝病變，肝臟細胞脂肪合成顯著增加，脂肪分解明顯減少，用該方法建立的小鼠模型，有穩定遺傳性，臨床癥狀與人類情況類似，成模時間短、效率高，死亡率低，不需要飲食誘導即可成模，具有較大的應用推廣前景，是藥物篩選和藥理學研究的理想的非酒精性脂肪肝動物模型。

技術領域

本發明涉及醫學動物模型的造模工藝技術領域，具體涉及一種非酒精性脂肪肝小鼠模型及其構建方法。

背景技術

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，是以彌漫性肝細胞肥大、泡性肝脂肪變性為病理特征的一類慢性肝病，近年來，NAFLD患者的數量在逐年升高，已嚴重威脅到人類健康，《中國脂肪肝防治指南(科普版)》(2018版)中顯示：中國非酒精性脂肪肝的患病率高達25％，其中15％發展成非酒精性脂肪性肝炎，少部分患者發展為肝硬化和肝癌，非酒精性脂肪肝病較為復雜，如若不及時加以控制，從而會導致炎癥反應和肝纖維化發生，它是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性等特征的病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化和脂肪性肝硬化4個病理過程，針對該病理過程，各醫學研究機構都在研究治療非酒精性脂肪肝病的特效藥，在此背景下無論是新藥的安全性評價還是藥物療效都需要有良好的動物模型進行檢測，非酒精性脂肪肝小鼠模型的高效穩定造模方法就變得格外重要。

目前，用于科學研究的非酒精性脂肪肝動物模型非常有限，且市場沒有具有穩定遺傳性的非酒精性脂肪肝模型小鼠，都是需要后天培養改造的，多采用飲食和四氯化碳注射誘導，建模時間較長，造模成功率低，死亡率高。

因此，發明一種非酒精性脂肪肝小鼠模型及其構建方法來解決上述問題很有必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種非酒精性脂肪肝小鼠模型及其構建方法，以解決目前用于科學研究的非酒精性脂肪肝動物模型非常有限，市場沒有具有穩定遺傳性的非酒精性脂肪肝模型小鼠，都是需要后天培養改造的，造模時間較長，造模成功率低，死亡率高的問題。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種非酒精性脂肪肝小鼠模型及其構建方法，具體構建步驟為：

步驟一：轉染小鼠胚胎干細胞，將包含ghr基因第4和第5外顯子片段(大小為10.8kb)利用Pfu Turbo DNA聚合酶擴增并克隆到pCR Blunt II-TOPO載體中，用BamHI和XbaI從中切下8kb片段，然后利用T4連接酶連接到含有胸苷激酶盒(Thymidine kinasecassette)的PL253載體上，用含有新霉素(neo)盒的PL452和PL451載體對該亞克隆基因組區域進行重組互換，插入2個Loxp位點和Frt-neo-Frt-LoxP盒，得到條件靶向載體，通過NotI限制性內切酶酶切將條件靶向載體線性化，使用電穿孔的辦法轉染小鼠胚胎干細胞；

步驟二：胚胎干細胞基因型驗證，將上述步驟一中轉染小鼠胚胎干細胞通過PCR基因型鑒定確定目的克隆，包括第一個LoxP位點、ghr外顯子4、兩個Frt位點和第二個LoxP位點；

步驟三：構建ghr flox小鼠模型，將上述步驟二中驗證準確基因型的胚胎干細胞注射到C57BL/6J小鼠囊胚中，通過與高效FLPo-deleter小鼠雜交去除neo盒，獲得ghr flox(GHR^fl/fl)小鼠；