[發(fā)明專利]一種不依賴錳離子的錳過氧化物酶突變體及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112195163B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莢榮;楊俊;李柳清
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽大學(xué)
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C02F3/34
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 喬恒婷

本發(fā)明公開了一種不依賴錳離子的錳過氧化物酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明在Il?MnP1氨基酸序列的基礎(chǔ)上，對第70位氨基酸殘基Arg和166位氨基酸殘基Glu進行定點突變，經(jīng)構(gòu)建表達菌株、誘導(dǎo)表達、變性復(fù)性和純化，獲得了突變體MnP(R70V/E166A)。本發(fā)明的突變體在不依賴Mn²⁺、pH偏中性環(huán)境中能有效地對蒽醌染料進行脫色，且對H₂O₂濃度的耐受性提高，這對由蒽醌染料引起的水體污染的治理具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種不依賴錳離子(Mn²⁺)的錳過氧化物酶突變體及其對蒽醌染料的脫色應(yīng)用。

背景技術(shù)

錳過氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP，EC1.11.1.13)是一種含有血紅素的過氧化物酶，主要由木生白腐真菌經(jīng)胞外分泌產(chǎn)生。由于MnP能夠降解難降解的芳香族化合物，包括合成染料。因此，該類酶在環(huán)境污染物治理中具有巨大的應(yīng)用前景。

蒽醌染料是一種被廣泛使用的顏色鮮艷的合成染料，其結(jié)構(gòu)特點是在稠環(huán)共軛體系中，含有兩個或兩個以上的羰基。由于其是酮式結(jié)構(gòu)，不易被氧化，不易發(fā)生光氧化反應(yīng)，具有很高的耐光牢度，從而它的可生化性極差，不易被降解，導(dǎo)致含有這類染料的廢水水體非常難脫色，進而造成水體的色度很高，嚴重影響了水體環(huán)境和水生動植物的正常生命活動。

大多數(shù)的MnP對蒽醌染料的降解需要Mn²⁺，且必須在pH偏酸性(pH 3.5-4.0)條件下發(fā)生反應(yīng)，這會進一步向水體中引入金屬離子，造成新的環(huán)境污染。但是還有一些MnP，能夠不依賴于Mn²⁺直接氧化一些小分子底物和染料，可是其催化氧化能力較差，且對H₂O₂的耐受性偏弱，因此，錳離子依賴性、偏酸性的pH條件、較低的催化氧化能力和較差的H₂O₂的耐受性限制了MnP的實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種不依賴錳離子的錳過氧化物酶突變體及其應(yīng)用。該突變體是對重組Il-MnP1第70位氨基酸殘基Arg和166位氨基酸殘基Glu進行定點突變而獲得，它能夠在沒有Mn²⁺、pH偏中性環(huán)境條件下有效地對蒽醌染料脫色，且對H₂O₂濃度的耐受性提高。

來源于真菌Irpex lacteus F17(CCTCC AF 2014020)的重組錳過氧化物酶Il-MnP1的氨基酸序列(AGO86670.2)如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明不依賴錳離子的錳過氧化物酶突變體MnP(R70V/E166A)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明錳過氧化物酶突變體MnP(R70V/E166A)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

步驟1：采用PCR的方法擴增獲得突變體的線性質(zhì)粒；

步驟2：將突變體的線性質(zhì)粒磷酸化并連接，得到重組載體；

步驟3：將重組載體轉(zhuǎn)化到表達菌株；

步驟4：培養(yǎng)表達菌株，誘導(dǎo)突變酶過量表達；

步驟5：變性、復(fù)性、回收并純化表達的突變酶(R70V/E166A)。

本發(fā)明的錳過氧化物酶突變體MnP(R70V/E166A)在沒有Mn²⁺、pH 5.5且H₂O₂濃度為0.4mmol/L的條件下對蒽醌染料Reactive blue 4的脫色率為59.4％，對Reactive blue 5的脫色率為80.8％，對Reactive blue 19的脫色率為90.56％，有望于對含有蒽醌染料的廢水水體進行脫色治理，具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明