[發明專利]一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202011246711.9
• 申請日: 2020-11-10
• 公開（公告）號: CN112342229A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 張天宇;田茜溶;高亞敏;王帥;余崴;方翠婷;張靜然
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/22
• 代理公司: 廣州長星專利商標代理事務所(普通合伙) 44662
• 代理人: 梁桂萍

1.一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌由轉移質粒pTXR和輔助質粒pUCTns構建；所述的構建方法包括以下步驟：

S1、準備轉移質粒pTXR和輔助質粒pUCTns；

S2、將表達轉座酶基因的輔助質粒pUCTns轉入肺炎克雷伯菌感受態細胞中，涂于卡那霉素抗性的LB培養基平板，得到含輔助質粒pUCTns的肺炎克雷伯菌；

S3、將含輔助質粒pUCTns的肺炎克雷伯菌制備成感受態，然后將轉移質粒pTXR轉入含輔助質粒pUCTns的肺炎克雷伯菌感受態細胞中，涂于安普霉素抗性的LB培養基平板，得到自主發光的肺炎克雷伯菌。

2.根據權利要求1所述的一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法，其特征在于，所述的構建方法還包括步驟S4、將步驟S3獲得的自主發光的肺炎克雷伯菌在無抗性LB液體培養基中傳代培養，篩選出抗性基因apr和pUCTns質粒均丟失的發光菌，獲得無抗性標記的自主發光肺炎克雷伯菌。

3.根據權利要求1所述的一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法，其特征在于，所述的轉移質粒pTXR按照順時針依次含有氨芐青霉素抗性基因bla、復制子oriR6kγ、接合轉移起始位點ori T、轉座子序列Tn7R至Tn7L攜帶的片段。

4.根據權利要求3所述的一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法，其特征在于，所述轉座子序列Tn7R至Tn7L攜帶的片段中，包括使肺炎克雷伯菌自主發光的一套luxCDABE基因以及用于篩選重組耐藥菌的抗性基因apr，apr的兩端帶有difR和difL序列，肺炎克雷伯菌通過自身的Xer解離酶系統自動將difR和difL序列之間的apr片段解離下來。

5.根據權利要求4所述的一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法，其特征在于，所述轉座子序列Tn7R至Tn7L攜帶的片段按順時針依次包含反向重復序列Tn7R、抗性基因apr、hsp60啟動子、luxCDABE基因和反向重復序列Tn7L。

6.根據權利要求1所述的一種無抗性標記自主發光肺炎克雷伯菌的構建方法，其特征在于，所述轉移質粒pTXR的構建方法，包括以下步驟：

(A1)將起始質粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Tp用限制性內切酶Xba I和BamH I消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳將不同大小DNA片段區分開，回收大片段產物；

(A2)以質粒pMABH1為模板，PCR擴增出kp-dif-apr基因片段后用限制性內切酶Xba I和BamH I消化并回收，然后將(A1)中的回收產物和回收的kp-dif-apr基因片段進行連接、轉化，得到質粒pAPR；PCR擴增使用的引物對如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

(A3)將質粒pAPR用限制性內切酶KpnΙ和NotΙ消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳將不同大小DNA片段區分開，回收小片段產物；

(A4)以質粒pP3-lux為模板，PCR擴增hsp60-luxCDABE基因片段，然后將(A3)中的回收產物和hsp60-luxCDABE基因片段進行同源重組、轉化，得到質粒pHSP；PCR擴增使用的引物對如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

(A5)將質粒pHSP用限制性內切酶ApaL I消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳將不同大小DNA片段區分開，回收大片段產物；

(A6)以質粒pTNS3為模板，PCR擴增bla-ori R6kγ基因片段，然后將(A5)中的回收產物和bla-oriR6kγ基因片段進行同源重組、轉化，得到質粒pTXR；PCR擴增使用的引物對如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。