[發明專利]一種用于抑制水產病原菌的中藥組合物

在審

• 申請號: 202011244823.0
• 申請日: 2020-11-10
• 公開（公告）號: CN112316023A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 楊培奎;鄭玉忠;張振霞;林敏;查廣才
• 申請（專利權）人: 韓山師范學院
• 主分類號: A61K36/79
• 分類號: A61K36/79;A61P31/04;C12Q1/18
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 涂琪順

1.一種用于抑制水產病原菌的中藥組合物，包括以下步驟，步驟一，原料選取；步驟二，藥劑浸泡；步驟三，單獨煎制；步驟四，離心過濾；步驟五，藥物篩選及優化組合；其特征在于：

其中上述步驟一中，人工選取色澤鮮明的丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角；

其中上述步驟二中，藥劑浸泡包括以下步驟：

1)人工將丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角進行篩分，并將其倒入清水中洗凈，隨后烘干；

2)將烘干后的丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角分別倒入打碎機中進行打碎加工，隨后倒出使用過濾網進行過濾；

3)將丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角分別倒入蒸餾水中浸泡，浸泡30-40min；

其中上述步驟三中，單獨煎制包括以下步驟：

1)人工將步驟二3)中丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角分別倒入鍋中，煮沸1-2h，隨后過濾收集濾液；

2)再將濾液倒入煎鍋中進行文火煎熬，直至濃縮至原來的二分之一；

3)關火靜置10-20min，直至混合物降溫至室溫，將冷卻后的混合物進行過濾篩分，隨后冷卻靜置備用；

其中上述步驟四中，離心過濾包括以下步驟：

1)將步驟三3)中丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角分別倒入離心機中，調節離心機至1200rpm，離心加工10-20min，收集上層濾液；

2)將濾液使用0.22μm濾膜過濾，將濾液分裝，即可得到用于抑制水產病原菌的中藥組合物，將其保存在-80℃冷藏室中保存；

其中上述步驟五中，藥物篩選及優化組合包括以下步驟：

1)采用圓盤擴散法測定所有中藥提取物的抑菌活性；取少量保種菌株接種于LB液體培養基中，并在30℃，150rpm恒溫搖床中培養18h；接著，吸取1mL菌液于1.5mL離心管中，6000rpm，離心2min，舍去菌液上清，用無菌生理鹽水稀釋菌體至1×10⁷CFU/mL，取100μL微生物懸浮液涂于LB固體培養基上；隨后，在LB固體培養基上放置半徑為6mm的滅菌濾紙，并用20μL的中藥提取液浸潤；將培養皿置于30℃培養24h，隨后測定抑菌圈直徑；以恩諾沙星，20μL，0.1mg/mL為陽性對照，以蒸餾水20μL為陰性對照；所有的分析都進行了三次；計算平均值，進行對比研究，根據抑菌圈直徑大小判定其抑菌能力的強弱；

2)用肉湯微量稀釋法測定提取物對被供試菌株的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度；首先，準備12個無菌離心管，在第一個離心管中加入500μL的中藥提取物并與1.5mL的LB液體培養基混合；隨后，吸取1mL以1∶1依次稀釋到第2至第11管，第12管作為空白對照；每管接種20μL菌懸液1×10⁶CFU/mL，所有試管30℃孵育24h；孵育后，每個試管中加入5μLMTT溶液，30℃孵育30min；有大量活菌的試管黃色染料會被還原為藍色，因此將抑制細菌生長且培養基未發生顏色變化的最高藥物濃度稱為最小抑菌濃度，所有的分析都重復三次；從加入MTT之后無顏色變化的試管中取部分液體培養基涂布于LB營養瓊脂板上，30℃培養24h，觀察是否有菌落；未長出菌落的試管的藥物濃度即為最小殺菌濃度，所有的分析重復三次；

3)采用微量肉湯棋盤稀釋法測定丁香、山茱萸、五味子、羅漢果、八角等5種中藥兩兩組合后的體外抑菌的聯用抑菌指數；根據體外抑菌試驗結果，選擇5種體外抑菌效果敏感藥物兩兩組合按照1∶1的比例進行配比，并測定聯用抑菌指數；FIC分數抑制濃度的計算方法如下：ΣFIC＝FICA+FICB，其中FICA為A藥聯合/MIC時A藥的MIC，FICB為B藥聯合/MIC時B藥的MIC；當FIC≤0.50時，為顯著協同作用；當0.50＜FIC≤1.0時，為協同作用；FIC＝1.0時，為相加作用；1.0＜FIC＜2.0時，為無關作用；FIC≥2.0時，為拮抗作用；所有的分析重復三次。

2.根據權利要求1所述的一種用于抑制水產病原菌的中藥組合物，其特征在于：所述步驟一中需要人工檢查丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角是否存在腐爛。

3.根據權利要求1所述的一種用于抑制水產病原菌的中藥組合物，其特征在于：所述步驟二2)中過濾網采用180-200目。