[發明專利]一種用于表征肺腺癌氣虛痰濕證的腸道菌群組合的篩選方法及腸道菌群組合及模型建立方法

在審

• 申請號: 202011243456.2
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112342161A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 柴可群;陳嘉斌;陳偉;王勝;沈建飛;馬德華;胡琴琴;徐國暑;張永軍
• 申請（專利權）人: 浙江省立同德醫院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/6869;C12Q1/6886;C12Q1/04;C12R1/01;C12R1/20;C12R1/145
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 李亦慈;唐銀益

1.一種表征肺腺癌氣虛痰濕證的腸道菌群組合的篩選方法，其特征在于運用16s RNA測序(16S ribosomal RNA sequencing)方法對經處理的糞便樣本進行測序，并運用宏基因組學測序結果進行驗證，包括如下步驟：

1)、獲取肺腺癌氣虛痰濕證、肺腺癌、健康人群的新鮮糞便樣本；

2)、提取微生物總DNA；

3)、PCR擴增、定量后在Illumina NovaSeq平臺上進行測序；

4)、生物信息分析；

5)、篩選腸道菌群：在屬水平上發現有287個重合菌群，其表達豐度前6位的依次是擬桿菌屬(Bacteroides)，糞桿菌屬(Faecalibacterium)，氏菌屬(Roseburia)，巨單胞菌屬(Megamonas)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，梭狀芽胞桿菌屬(Lachnoclostridium)；

6)、篩選具有差異性的腸道菌群組合：首先運用LEfSe(LDA Effect Size)分析方法，在屬水平上發現肺腺癌氣虛痰濕證和肺腺癌之間存在擬桿菌屬(Bacteroides)，狄氏副擬桿菌(Parabacteroides)，普氏菌屬(Prevotella)和黃桿菌屬(Flavonifractor)這4個菌群重合；其次運用Pearson分析構建了穩定的共生網絡，該結果通過了宏基因組學測序驗證；最后以擬桿菌屬(Bacteroides)，狄氏副擬桿菌(Parabacteroides)，普氏菌屬(Prevotella)和黃桿菌屬(Flavonifractor)這4個菌群的相對表達豐度作為變量建立邏輯斯蒂(Logistic)回歸模型，其AUC值為0.989；代入宏基因組檢驗結果進行驗證，其AUC值為1.0，所述的邏輯斯蒂(Logistic)回歸模型如下：

b1＝The relative abundance of Bacteroides

b2＝The relative abundance of Prevotella

b3＝The relative abundance of Parabacteroides

b4＝The relative abundance of Flavonifractor

其中Y為邏輯斯蒂的運算值，e為自然對數。

2.根據權利要求1所述的表征肺腺癌氣虛痰濕證的腸道菌群組合的篩選方法，其特征在于，其特征在于步驟1)-4)具體包括如下步驟：

1)、獲取樣本的新鮮糞便樣本：清晨收集新鮮糞便5-10g放入采樣管中，蓋緊，液氮速凍，置于冰箱保藏；

2)、微生物總DNA的提取：常溫解凍、經E.Z.N.A.試劑盒提取微生物總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，采用紫外分光光度計對DNA進行定量；

3)、PCR擴增、定量后在Illumina NovaSeq平臺上進行測序：PCR擴增，使用靶向區引物對DNA樣品進行測序，擴增文庫的大小和數量分別在Agilent 2100生物分析儀和Illumina定量試劑盒(Kapa Biosciences)進行評估，在Illumina NovaSeq平臺上進行測序；

4)、生物信息分析：使用SILVA數據庫和NT-16S進行序列的物種注釋，使用QIIME2計算α和β多樣性，使用PICRUSt(v1.1.2)進行功能分析。

3.根據權利要求2所述的表征肺腺癌氣虛痰濕證的腸道菌群組合的篩選方法，其特征在于：

所述的步驟6)中，篩選顯著的腸道菌群通過：首先運用LEfSe(LDA Effect Size)分析方法進行初篩，設定P＜0.01和LDA值＞4.0；而后運用Pearson分析構建共生網絡獲得穩定結果，設定P＜0.01和lcorl值＞0.4。

4.一種用于表征肺腺癌氣虛痰濕證的腸道菌群組合，其特征在于，所述的腸道菌群組合在屬水平上發現的重合菌群中，分布前6位的是擬桿菌屬(Bacteroides)，糞桿菌屬(Faecalibacterium)，氏菌屬(Roseburia)，巨單胞菌屬(Megamonas)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，梭狀芽胞桿菌屬(Lachnoclostridium)。