[發明專利]一種高通量鑒定椰棗樹性別的方法

在審

• 申請號: 202011238725.6
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112176097A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 王永;石鵬;張大鵬;肖勇;李志瑛
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院椰子研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6879;C12Q1/6851
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

本發明屬種苗繁育技術領域，涉及一種高通量鑒定椰棗樹性別的方法，先提取椰棗樹DNA，再進行熒光定量PCR擴增，獲得熔解曲線，根據熒光定量PCR的熔解曲線情況鑒別出椰棗樹的雌株和雄株。本發明采用熒光定量PCR技術，通過384孔熒光定量PCR擴增，通量更高，并且直接通過熔解曲線圖的單峰或雙峰鑒定椰棗樹性別，可以在育苗階段將雄性種苗分離出來，無需凝膠電泳，無需等到多年以后發現不結果時再剔除成年雄株，從而節約了時間和成本，對于椰棗種苗質量及育苗成本控制具有重要意義，在椰棗種苗繁育領域應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬種苗繁育技術領域，涉及一種植物性別鑒定方法，具體涉及一種利用熒光定量PCR技術高通量鑒定椰棗樹性別的方法。

背景技術

椰棗(Phoenix dactylifera)又名海棗、伊拉克蜜棗，雌雄異株，原產于西亞和北非，是人類最早馴化的果樹之一。椰棗是阿拉伯國家的重要木本糧食作物，被譽為“阿拉伯民族之樹”，在中東阿拉伯國家的生態和經濟建設中發揮著重要作用。椰棗營養豐富，約三分之二的成分為果糖，被譽為“沙漠面包”，長期以來一直是地中海、紅海沙漠地帶的主要食品。南美、南亞各國均有引種，其中以伊拉克、埃及、沙特阿拉伯和伊朗栽培面積最大。唐代傳入中國，目前在海南、云南和廣東等地都有栽培。

椰棗的自然壽命可達100多年，但經濟壽命一般為25-30年，在商業種植園中需定期更新，因此，在育苗階段把控種苗質量至關重要。椰棗目前主要通過分蘗和種子進行種苗繁育，但分蘗的繁殖系數十分有限，并且存在運輸不便等問題；椰棗種子的發芽率一般超過80％，具有繁殖系數大、繁殖效率高等優勢。椰棗商業種植園以種植雌株、獲取果實為主要目的，僅需配置極少量的雄株(2％-3％)作為授粉樹，因此，種子育苗需要解決雌雄異株的問題，保證種苗繁育以雌株為主。由于椰棗種苗在定植后一般需要生長5-8年才能開花結果，而在育苗及種植管理過程中需要花費大量的人力、物力和財力，若雄株種植過多則會影響產量，從而造成經濟損失，故在種苗繁育階段解決雌雄異株的問題對于椰棗商業種植、對椰棗產業發展尤為重要。中國專利“一種鑒別椰棗樹性別的方法”(專利號：ZL 2018 10250068.3)應用SSR分子標記在育苗階段對椰棗種苗性別進行早期鑒定，然而其通量相對較低、PAGE電泳檢測步驟較復雜、成本較高。

發明內容

本發明的目的是提供一種高通量鑒定椰棗樹性別的方法，應用熒光定量PCR技術在育苗階段對椰棗樹的性別進行早期鑒定，對于椰棗種苗質量控制及種植業發展具有重要意義，在椰棗種苗繁育等領域應用前景廣闊。

本發明所采用的技術方案：

一種高通量鑒定椰棗樹性別的方法，其具體步驟如下：

1、從椰棗幼嫩組織中提取DNA；

所述椰棗幼嫩組織是指椰棗的葉片、花序或莖；

2、對所提取的DNA利用引物進行熒光定量PCR擴增，同時獲得熔解曲線；所述引物為M1，其序列分別為：

正向引物序列：5'-TGGCAGAGAAGTGATTTGAAGA-3'；

反向引物序列：5'-TAGGCAAGGTGGCTGATTAGTT-3'；

所述引物為M2，其序列分別為：

正向引物序列：5'-TGGCAGAGAAGTGATTTGAAGA-3'；

反向引物序列：5'-CAATTCCCTCGATTTCCTCA-3'；

所述引物為M3，其序列分別為：

正向引物序列：5'-CTTCTGGTTTCCATGTTGTTCA-3'；

反向引物序列：5'-GGTTATTTTGAGTTCCACGAGC-3'；