[發明專利]一種雙信號輸出的病原微生物快速檢測方法

在審

• 申請號: 202011238234.1
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112557651A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 王利華;吳文輝;董軍;邵志勇;白向茹;王佳慧;鄭思潔;李婷婷;戰藝芳;王嫦嫦
• 申請（專利權）人: 武漢市農業科學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;G01N21/64;G01N21/78
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明公開了一種雙信號輸出的病原微生物快速檢測方法，該方法利用病原微生物與核酸適配體之間的特異性結合，以及雙鏈DNA特異性核酸酶對兩者結合后形成的結構的破壞作用，使得介孔硅納米材料內的鄰苯二胺分子得以釋放，釋放后的鄰苯二胺分子進一步與Ag⁺溶液混合，生成黃色的氧化產物，該產物同時具有熒光信號，且該產物濃度與待測樣品中的病原微生物濃度成正比。基于此，通過比色和熒光雙信號輸出，借助肉眼或便攜式熒光分析儀可實現病原微生物的間接定性、定量檢測。

技術領域

本發明涉及病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種雙信號輸出的病原微生物快速檢測方法，尤其涉及一種基于介孔氧化硅納米材料、核酸酶循環信號放大以及比色和熒光雙信號輸出的病原微生物快速檢測方法。

背景技術

病原微生物包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌等，是引起食源性疾病的首要原因，其不僅嚴重影響人們的生命健康，而且影響全球經濟的發展。因此，為保障國計民生，在食品或農產品進入市場流通前，非常有必要對微生物種類和含量進行快速篩查與檢測。

目前，常見的病原微生物檢測方法主要有培養法、PCR法以及ELISA法三大類。其中培養法作為微生物檢測的金標方法，盡管結果準確，但通常需要經過分離、鑒定、培養以及計數等環節，操作復雜耗時，一般需要3-5天。而PCR法和ELISA法盡管檢測時間大大縮短，但需依賴昂貴的專用儀器以及專業的技術人員，并且對復雜樣品難以適用。綜上，以上方法均難以滿足當前病原微生物現場快速檢測的迫切需求。因此，發展一種簡單、快速、廉價、準確、高靈敏的病原微生物檢測方法，對有效預防和控制食源性疾病的暴發，減輕病原微生物對人類造成的危害意義重大。

近年來，病原微生物的快速檢測發展迅速，目前已發展了多種基于電化學、熒光、表面增強拉曼光譜等技術的快速檢測方法。然而，上述方法通常是基于單一信號的變化對目標物進行檢測。這種單信號輸出的方式易受操作人員、實驗環境等的影響致使結果不夠準確。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種雙信號輸出的病原微生物快速檢測方法，該方法不需要昂貴的儀器和試劑，且可通過比色法和熒光法進行檢測，準確性高。

為了實現上述目的，本發明的技術方案具體如下：

一種雙信號輸出的病原微生物快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、將介孔硅與鄰苯二胺混合，得到介孔中負載有鄰苯二胺分子的介孔硅，記為產物A；

S2、采用待測病原微生物的核酸適配體封閉步驟S1所述產物A，得到產物B；

S3、將待測樣品、核酸酶以及步驟S2所述產物B置于同一反應體系中，反應后離心取上清液；

S4、將步驟S3所述上清液與Ag⁺溶液混合，通過比色或熒光檢測，對病原微生物的濃度進行定性和定量分析；

其中，所述介孔硅為表面修飾了氨基的介孔氧化硅納米球，其粒徑為50-200nm，孔徑為2-4nm；所述核酸酶為雙鏈DNA特異性核酸酶。

進一步地，在上述技術方案中，步驟S1所述產物A的制備方法為：將介孔氧化硅納米球超聲分散在Tris-HCl緩沖液中，攪拌條件下，逐滴加入鄰苯二胺溶液后，室溫振蕩反應4-6h，使得鄰苯二胺分子充分擴散到介孔氧化硅納米球的孔中，得到含有產物A的懸浮液；所述鄰苯二胺溶液的溶劑為無水乙醇和Tris-HCl緩沖液的混合液；更進一步地，所述無水乙醇與Tris-HCl緩沖液的體積比為1:1，所述鄰苯二胺溶液的濃度為10-20mg/mL。