[發明專利]一種人源黑素瘤細胞A375/DR5穩轉株裸鼠移植瘤模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202011237899.0
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112369369B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 丁寶月;李明娟;張潔;詹淑玉;丁雪鷹;武鑫;孫李丹;呂曉慶;劉國強;敖雷
• 申請（專利權）人: 嘉興學院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/867;A61K49/00
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 李陽

1.一種人源黑素瘤細胞A375/DR5穩轉株裸鼠移植瘤模型的構建方法，其特征在于，是選用人源黑素瘤高轉移細胞株A375為成瘤細胞，先將DR5基因穩定轉入人源黑素瘤細胞A375，經篩選后獲得造模用的DR5穩定高表達的A375/DR5細胞株，再將其通過背部皮下注射建立所述的人源黑素瘤細胞A375/DR5穩轉株裸鼠移植瘤模型；所述的DR5基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述的構建方法為：將DR5穩定高表達的A375/DR5細胞株置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養液中，37℃、5％CO₂培養；取對數生長期細胞制成濃度為1×10⁷個/ml的細胞懸液，放置4℃預冷后，加等體積基質膠，混合均勻，整個混勻過程中與基質膠接觸的吸管都必須4℃預冷后方可使用，操作過程在冰上進行；混勻后，冰浴備用；選取BALB/c裸鼠，取細胞懸液0.2ml/只接種至裸鼠背部皮下；飼養15-20天后，選取腫瘤形態圓潤，致密，而且腫瘤直徑達到10mm的裸鼠，作為黑色素瘤動物模型；所述的DR5穩定高表達的A375/DR5細胞株的制備方法，包括以下步驟：

A、攜目的基因的質粒的構建：pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro載體圖譜構建：根據DR5的序列，設計目的片段，插入MCS區，由CMVIE啟動子調控表達，該載體中含有EF1啟動子調控的ZsGreen基因和Puro共表達；

B、慢病毒包裝：制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6h更換為完全培養基，培養48h和72h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，0.45um濾器過濾病毒上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒；對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液；500ul新鮮培養液重懸病毒沉淀，置于-80度甚至液氮保存；滴度測定；

C、TNFRSF10B慢病毒A375細胞建系：將A375細胞鋪盤于6孔板，每孔為5×10⁵細胞，每孔加入不同的慢病毒pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro和TNFRSF10B，MOI＝6，24小時后換液；48小時后，更換含1ug/ml的puromycin的培養液進行篩選，待細胞生長穩定之后，可以進行細胞傳代；2代之后，待細胞數量達到要求，凍存細胞；

D、穩轉株驗證：對篩選出的細胞株進行鑒定，得到DR5穩定高表達的A375/DR5細胞株。

2.一種采用如權利要求1所述的方法構建得到的人源黑素瘤細胞A375/DR5穩轉株裸鼠移植瘤模型在抗黑素瘤主動靶向藥物評價中的應用。